劉 念，李玉紅，2，鄭恩金,高大慶，陸承平

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基于RNA-seq分析Eha調(diào)控遲緩愛德華菌抵抗酸化的作用

劉 念1，李玉紅1，2，鄭恩金1,高大慶1，陸承平3

目的 Eha是一個影響遲緩愛德華菌(Et)胞內(nèi)生存的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,本研究有助于揭示其調(diào)控Et抵御酸的分子機制。方法 用ATPase 抑制劑洛霉素A1抑制巨噬細胞的酸化，菌落計數(shù)法比較酸化對野生株和eha基因缺失株胞內(nèi)存活數(shù)目的影響；比較兩種細菌在酸性應(yīng)激實驗中存活率的差異;構(gòu)建pMP220-PehaLacZ質(zhì)粒，采用β-半乳糖苷酶實驗檢測eha基因的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性；選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間,分別提取兩種細菌RNA,進行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR驗證其結(jié)果。結(jié)果 野生株ET13在巨噬細胞內(nèi)和不同pH酸環(huán)境中的存活率明顯高于缺失株，阻止酸化胞內(nèi)菌數(shù)明顯高于未阻止酸化的胞內(nèi)菌數(shù)(P<0.05)。對數(shù)期細菌pH6.3培養(yǎng)基生長2 h，RNA-Sequencing結(jié)果表明：eha基因缺失株轉(zhuǎn)錄水平和野生株相比，147個差異顯著表達的基因(DEGs)(|log2 Ratio|≥1)，其中113個上調(diào)，34個基因下調(diào)，qRT-PCR隨機抽樣，和RNA-Sequencing 表達趨勢呈強相關(guān)。147個基因采用GO數(shù)據(jù)庫進行功能聚類,分成25類,主要涉及細菌加工、定位、代謝、結(jié)合、催化、運輸、細胞成份；基于KEGG通路的富集分析,有130個可以富集到55條通路中，包括與氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)代謝及鐵的轉(zhuǎn)運等路徑，涉及基因較多的有雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、不同環(huán)境中的微生物代謝和次級代謝產(chǎn)物等路徑。結(jié)論 在酸性生存環(huán)境，Eha對Et的轉(zhuǎn)錄組呈多途徑、多基因的適應(yīng)性的全局性調(diào)控。

eha基因；RNA-sequencing；E.tarda；酸化

遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda，簡稱Et)屬于腸桿菌科愛德華菌屬，該菌能夠感染多種魚類，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體[1]。Et也可感染人，引起人的胃腸炎、腹膜炎、敗血癥和腦膜炎等疾病[2]。Et溶血調(diào)控基因(Et haemolysin activator gene，簡稱eha)是Et一個重要的毒力調(diào)控基因[3-4]，Et菌能夠抵抗巨噬細胞吞噬體內(nèi)氧化和酸化的殺菌而生存繁殖，是其致病的關(guān)鍵[5]，eha基因缺失引起Et 在巨噬細胞內(nèi)繁殖率降低的機制[6],尚未完全研究清楚。高通量測序技術(shù)，具有測序通量高、成本低、速度快等特點，廣泛應(yīng)用于動植物及微生物的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域的研究。

近年來，隨著新一代高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing technology)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing，RNA-Seq)技術(shù)已成為測序技術(shù)的重要手段。本研究首先分析Eha在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞酸化殺菌的作用，采用RNA-Seq比較在酸性條件下,ET-13野生株和eha基因缺失株轉(zhuǎn)錄組表達差異的基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)，通過生物信息學(xué)對其數(shù)據(jù)進行定性定量的分析，旨在分子水平識別DEGs的功能及其代謝通路，并利用熒光定量PCR隨機抽樣,驗證DEGs表達趨勢，初步探索Eha在調(diào)控Et抵御巨噬細胞酸化殺菌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 Et毒力株 ET13為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平教授惠贈；ET13的eha基因缺失株為本室保存；鼠源巨噬細胞RAW264.7為上海獸醫(yī)研究所王少輝博士惠贈;pMP220-PehalacZ質(zhì)粒東南大學(xué)毛曉華教授惠贈。細菌培養(yǎng)基(Luria Broth，LB)：細胞培養(yǎng)液(Dulbecco’s Minimum Essential Medium，DMEM)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)均購自Gibco公司。

1.2 抑制酸化對細菌胞內(nèi)存活的影響 方法參考文獻[6]，實驗組用含1 μmol/L ATPase 抑制劑洛霉素(Bafilomycin，BAF)A1的培養(yǎng)液處理細胞30 min，以阻止細胞吞噬體酸化，對照組用正常細胞培養(yǎng)液。對數(shù)期ET13野生株和eha缺失株以10∶1的感染復(fù)數(shù) (Multiplicity Of Infection，MOI)分別加入24孔單層細胞。共孵育1 h后，再用含慶大霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)液殺胞外的細菌1 h，此時定為0 h；換用含慶大霉素(10 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0 h，2 h，4 h 或 6 h。在預(yù)定時間點，加入1 mL 1% Triton X-100裂解細胞10 min，將裂解產(chǎn)物經(jīng)稀釋，涂平板,培養(yǎng),菌落記數(shù)。以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)(CFU/mL)為縱坐標(biāo)，繪制細菌胞內(nèi)細菌數(shù)目和時間曲線。

1.3 酸性環(huán)境的應(yīng)激實驗 方法參考文獻[6],對數(shù)期的菌體用PBS(pH7.2)漂洗2次后，菌液 OD600調(diào)節(jié)為0.5。菌液分為兩等份，一組為實驗組,經(jīng)不同pH(7.2，6.3，5.5，4.8,4.3)LB處理2 h，另一組作為對照組,正常培養(yǎng)。然后進行兩組培養(yǎng)液系列稀釋，涂平板，計數(shù)菌落。菌液濃度=平板菌落數(shù)/mL×稀釋倍數(shù)，細菌存活率=實驗組菌液濃度(CFU/mL)/對照組菌液濃度(CFU/mL)×100%。

1.4 構(gòu)建eha基因的啟動子和LacZ融合質(zhì)粒及β-半乳糖苷酶實驗 以ET13基因組DNA為模板,擴增eha的啟動子區(qū)域,將該片段插入 pMP220-LacZ載體中,構(gòu)建了eha基因的啟動子探針載體pMP220-PehaLacZ，然后將該載體電極導(dǎo)入eha基因缺失株中，檢測eha基因的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性，選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間。

1.5 提取細菌的RNA 野生株與eha基因缺失株分別在pH值7.2的LB培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD值0.8)，再在pH值6.3的LB培養(yǎng)2 h。分別提取兩種細菌的RNA，并檢測其濃度(μg/μL)和純度(OD260/OD280，OD260/OD230)，及RNA完整性計數(shù)(RNA Integrity Number，RIN)。

1.6 cDNA文庫的構(gòu)建與Illumina測序儀測序 根據(jù)細菌mRNA純化試劑盒的說明書提供的方法，將提取的總RNA中16S rRNA 與23S rRNA 除去，用帶有Oligo T(dT)的磁珠對mRNA進行富集純化。mRNA打斷成100-500 nt短片段后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,3′末端加polyA并連接測序接頭，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增得到測序文庫，上機進行 Illumina Hi Seq 2000 測序(深圳華大基因公司完成)。

1.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為原始標(biāo)簽(raw read)，再進行過濾得到凈標(biāo)簽(clean read)，用于后續(xù)分析。該序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve數(shù)據(jù)庫，登錄號：SRX 1898774。

1.8 差異表達基因分析 利用短reads比對軟件SOAPaligner/SOAP2 軟件,將測序數(shù)據(jù)與E.tarda菌ATCC15947參考基因組序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/)進行比對,統(tǒng)計clean reads 參考基因組及基因序列上的分布情況及覆蓋度;利用 RPKM(Reads Per Kb per Million)法計算基因的表達量，用于比較兩樣品間基因的差異表達情況，以p-value做多重假設(shè)檢驗校正，通過控制錯誤發(fā)生率(false discovery rate，F(xiàn)DR)來決定P閾值;采用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www. genome. jp/kegg/)進行差異表達基因的功能聚類和生物學(xué)功能分析。

1.9 實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR) 分別提取野生株與eha基因缺失株的RNA，隨機選取RNA-seq差異顯著15個基因,根據(jù)表1設(shè)計引物，操作按試劑盒說明書，反應(yīng)在ABI7300型熒光定量PCR儀上進行，以16S rRNA基因的表達量作為內(nèi)標(biāo)參照，采用2-ΔΔct法計算eha基因缺失株的基因轉(zhuǎn)錄水平相對野生株的倍數(shù),這些基因的表達趨勢和RNA-seq表達的基因趨勢做相關(guān)性分析。

表1 qRT-PCR引物序列,產(chǎn)物大小和變性溫度

Tab.1 Primer sequence product size and annealing temperature for RT-qPCR

GenePrimersequence(5′→3′)Productsize/bpAnnealingtemperature/℃UpregulatedETATCC＿RS01560GCCAGCACAGGTGATCTCGGCGAGGATACGGACATGAGCC13459．50ETATCC＿RS01555TGGAGCCATTATCACTTTCGCGATCTGCGCTAATACCTCC15457．45ETATCC＿RS05005TGGGCGTCGGTGCCTTCTTCGCCATCGCCAACAGGAATAG16657．55ETATCC＿RS11570CTATCGCCAAACCCATTACCTCGTCACCGACTACAAACCA14155．40ETATCC＿RS13205TTCCTGCGGCACAGTTGAAGGCATTGGCTGATTGGTTG19058．00ETATCC＿RS14200TCTTCCAGCAGGGATTCGGGCTGGTCTTGGCTACCGTCA14759．50ETATCC＿RS11220GGTGGACGAGGCGTTCCTTCAATAGCGGCAGCGACAGC17262．00ETATCC＿RS10525CATTGGTGCGCCTGGAAGAACACGCCGATGGTGAACGT16860．00ETATCC＿RS09485TGGCGCTAGTGCAAGAACATACGGCATGGATGCTGACC15558．00ETATCC＿RS14205GCCATCTGGATCGGTAACTTCATCTCCTGCACATTGACGT16855．40DownregulatedETATCC＿RS16120TAGCTGATCCAGCGTCCTGGCGTTTGAAGCCGTTAGAG14558．00ETATCC＿RS06155ACTTTGCCGTGTTTGTCGCGCAGGGTTGAACAGCAGGA12458．00ETATCC＿RS11420TTGGATCTGGAGAAGGGTGCTGCAATGTTGTCGAGGAGT14258．00ETATCC＿RS00925TGACCGTGCGTGGTAATCCGCGGCTGTAGTGCTTCTGG18660．00ETATCC＿RS10185AACTTGGTCGGTTGGGATGGCTGTGACGGGAGTTAGGC12059．45

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR基因的表達趨勢和RNA-seq表達的基因趨勢,用R2做相關(guān)性分析，R2>0.75表示強相關(guān)性，0.75>R2>0.45表示中等相關(guān)性，R2<0.45表示弱相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 比較抑制酸化對ET13野生株和eha基因缺失株在胞內(nèi)存活的影響 從圖1中可以看出，先用ATPase 抑制劑洛霉素A1處理巨噬細胞,以阻止酸化，再用野生株和eha基因缺失株分別感染RAW264.7細胞1 h，慶大霉素殺胞外菌1 h，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 或6 h時，它們胞內(nèi)CFU/mL明顯高于各自未阻止酸化的胞內(nèi)CFU/mL(P<0.05)，表明巨噬細胞的酸化在抑制Et胞內(nèi)繁殖中起了很大作用,但酸化對野生株和缺失株各自抑制程度明顯不同。繼續(xù)培養(yǎng)6 h時，未阻止酸化野生株胞內(nèi)CFU/mL和未阻止酸化eha基因缺失株胞內(nèi)CFU/mL差異明顯(P<0.05)，這說明eha基因在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞酸化殺菌中起了重要作用，但同時,阻止酸化野生株胞內(nèi)CFU/mL和阻止酸化eha基因缺失株胞內(nèi)CFU/mL差異也明顯(P<0.05)，這也說明eha基因在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞殺菌中其它機制也起作用,如我們以前的研究表明,Eha蛋白能夠調(diào)控Et 抵抗Mф 氧化殺菌的作用[6]。

圖1 比較酸對野生株和eha基因缺失株巨噬細胞胞內(nèi)存活的不同影響Fig.1 Comparison of the differences of the intracellular survival rates of the wild type and its eha mutant in macrophages against acid

2.2 比較經(jīng)不同pH LB處理,野生株和eha基因缺失株存活率的差異 模擬細菌在巨噬細胞吞噬溶酶體中酸性的環(huán)境，對數(shù)期細菌經(jīng)不同pH(7.2，6.3，5.5，4.8,4.3)LB處理細菌2 h后，結(jié)果如圖2所示，eha基因缺失株的存活率明顯低于野生株(P<0.05)，互補株的存活率介于缺失株和野生株之間。結(jié)果表明,eha基因在細菌在體外抵御酸的殺菌機制中起重要作用。

圖2 比較不同pH酸對野生株和eha基因缺失株存活率的影響Fig.2 Comparison of the differences of the survival rates of the wild type and its eha mutant against different pH acid

2.3 檢測eha基因的啟動子在不同環(huán)境刺激下的轉(zhuǎn)錄活性 體外模擬在巨噬細胞酸的生存環(huán)境，分別在不同時間和pH值的LB培養(yǎng)Et菌，檢測含pMP220-PehaLacZEt菌的β-半乳糖苷酶活性,結(jié)果表明，對數(shù)期的Et菌在pH值6.3的LB培養(yǎng)2 h，Eha轉(zhuǎn)錄水平最高。

2.4 轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)評估 提取野生株與eha基因缺失株RNA濃度分別為1.905 μg/μL和1.255 μg/μL;純度:OD260/OD280，≥1.9，OD260/OD230≥2.0；RIN：10.0,表明其純度高,滿足建庫要求。為了構(gòu)建Et菌的cDNA文庫，其mRNA被隨機性打斷。其隨機性評估表明,ET13菌野生株和缺失株轉(zhuǎn)錄組測序不同的長度的clean reads在基因組中分布均勻。利用軟件將成功比對到基因組上的clean reads與參考基因序列進行比對，進行基因覆蓋度分析，結(jié)果表明，野生株和eha基因缺失株的clean reads中覆蓋率在90%以上的基因分別超過92%。

2.5eha基因缺失株和野生株差異表達基因比較和功能聚類分析 利用RPKM法計算兩種細菌基因的表達量,閾值設(shè)為:|log2 Ratio|≥1,FDR≤0.001。在ET13野生株中，共有147個基因的轉(zhuǎn)錄水平與eha基因缺失株相比差異顯著，其中113個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，34個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。采用GO數(shù)據(jù)庫對147個差異表達的基因進行功能聚類分析,分成25類,這些基因主要涉及細胞加工(68個)、定位(30個)、結(jié)合(59個)、催化(83個)、運輸 (27個)、代謝 (78個)、細胞成份(37個)和細胞膜(33個) (圖3)，Eha在酸性條件下調(diào)節(jié)這些基因。

基于KEGG通路的顯著性富集分析,能確定DEGs參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)。結(jié)果顯示，147個DEGs中，有130個基因可以富集到55條通路中，包括10條與氨基酸代謝相關(guān)的路徑，16條與碳代謝、脂質(zhì)、酯酸及能量代謝相關(guān)的路徑，4條與核苷酸代謝相關(guān)的路徑，3條與硫代謝相關(guān)的路徑，以及一些與氮代謝、鐵的轉(zhuǎn)運等相關(guān)的路徑。涉及差異表達基因較多的代謝路徑主要有(|log2 Ratio|≥1) (表2)：雙組分系統(tǒng)路徑(20個)，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)路徑(12個)，不同環(huán)境中的微生物代謝路徑(21個)和次代謝的合成路徑(17個)。

2.6 實時熒光定量PCR 隨機選取 15個DEGs進行qRT-PCR,驗證RNA-seq測結(jié)果。兩種方法結(jié)果表明，14個基因的表達趨勢出現(xiàn)了一致的結(jié)果，其相關(guān)性為強相關(guān)(R2=0.799>0.75)，僅ETATCC-RS11570基因在eha基因缺失株和野生株中通過qRT-PCR檢測無明顯差異，與RNA-seq結(jié)果不一致(圖4)。

圖4 比較qRT-PCR和RNA-seq發(fā)現(xiàn)的差異表達基因Fig.4 Comparison of significantly different expressed genes by qRT-PCR和RNA-seq

Classification of DEGs between the wild type and the eha mutant，according to GO functional analysis (|log2 Ratio|≥1).圖3 ET 13 eha基因缺失株和野生株差異表達基因比較和聚類分析Fig.3 Classification of significantly different expressed genes between the wild type and its eha mutant of ET 13

3 討 論

本研究首先用洛霉素A1抑制酸化和菌落計數(shù)法,比較酸化對ET13株和它的eha基因缺失株胞內(nèi)存活數(shù)目的影響,以及比較兩種細菌在體外酸性應(yīng)激實驗中存活率的差異,發(fā)現(xiàn)了Eha在調(diào)控Et菌抵御巨噬細胞酸化殺菌和體外酸性環(huán)境中的重要作用。然后，采用β-半乳糖苷酶實驗檢測eha的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性；選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間,分別提取兩種細菌RNA,進行RNA-Seq，比較ET13株和eha基因缺失株的轉(zhuǎn)錄組表達,發(fā)現(xiàn)了147個DEGs，對它們進行GO功能聚類和KEGG通路分析，結(jié)果如下：

為了生存和適應(yīng)外界環(huán)境，細菌通過雙組分系統(tǒng)(Two-component system，TCS)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來響應(yīng)環(huán)境信號并對刺激作出應(yīng)答。本研究提示，20個DEGs涉及TCS系統(tǒng)路徑。在酸壓力下,eha基因缺失株中有7個DEGs上調(diào)，13個DEGs下調(diào)。ETATCC_RS06140、ETATCC_RS06135 和ETATCC _RS06130分別編碼檸檬酸裂合酶CitC的α、β、γ亞基，ETATCC_RS06145和ETATCC_RS06150編碼CitG亞基。檸檬酸裂合酶是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，已經(jīng)報道，檸檬酸裂合酶基因突變的Et在感染魚的模型中生存力和致病性明顯下降[7]。ETATCC_RS14195和ETATCC_RS00005以及ETATCC_RS12655分別編碼谷氨酰胺酶和絲氨酸脫水酶。幽門螺桿菌產(chǎn)生的谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺脫氨,中和胃酸，這和該菌在胃的生存能力和致病性有關(guān)[8]。ETATCC_RS16530編碼一種外膜蛋白，它負責(zé)將莢膜多糖從周質(zhì)間隙運輸?shù)骄w表面，而莢膜直接參與細菌對環(huán)境的抗逆性[9]。Et菌通過Eha調(diào)控這些基因的表達量以抵抗酸性環(huán)境的刺激，增加其在細胞內(nèi)的存活能力。

表2 基于KEGG通路分析在酸性條件eha基因調(diào)控差異明顯表達的基因

Tab.2 KEGG pathway analysis of theeha-dependent genes differentially expressed in an acid condition

PathwayGeneIDGenedescriptionRNA?Seq?Two?componentsystemETATCC＿RS04225hydrogenase2smallsubunit1．229ETATCC＿RS01230multidrugtransporter1．133ETATCC＿RS14195glutaminase1．096ETATCC＿RS081653?demethylubiquinone?93?methyltransferase1．082ETATCC＿RS00005serinedehydratase1．080ETATCC＿RS12655serinedehydratase1．045ETATCC＿RS02740transcriptionalregulator1．025ETATCC＿RS06125[citrate[pro?3S]?lyase]ligase-3．916ETATCC＿RS06135citratelyasesubunitbeta-3．269ETATCC＿RS06130citratelyasesubunitgamma-3．255ETATCC＿RS07080putativecitratetransporter-2．859ETATCC＿RS06140citratelyasesubunitalpha-2．725ETATCC＿RS061502?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephosphoCoAsynthase-2．423ETATCC＿RS06155antiporter-2．372ETATCC＿RS061452?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephospho?CoAsynthase-2．347ETATCC＿RS16525proteintyrosinephosphatase-2．234ETATCC＿RS16530polysaccharideexportproteinWza-2．202ETATCC＿RS04890aminoacidtransporter-1．216ETATCC＿RS16520tyrosineproteinkinase-1．142ETATCC＿RS11420flagellarproteinFliS-1．115BiosynthesisofsecondarymetabolitesETATCC＿RS10420tryptophansynthasesubunitalpha2．208ETATCC＿RS10415tryptophansynthasesubunitbeta1．787ETATCC＿RS16110inosine?5?monophosphatedehydrogenase1．400ETATCC＿RS02195phosphoribosylglycinamideformyltransferase1．383ETATCC＿RS06795threoninedehydratase1．341ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS081653?demethylubiquinone?93?methyltransferase1．082ETATCC＿RS00005serinedehydratase1．080ETATCC＿RS10525glyoxylatereductase1．080ETATCC＿RS12655serinedehydratase1．045ETATCC＿RS12785riboflavinsynthasesubunitalpha1．041ETATCC＿RS02280succinyl?diaminopimelatedesuccinylase1．039ETATCC＿RS041802?succinyl?5?enolpyruvyl?6?hydroxy?3?cyclohexene?1?carbox?ylatesynthase1．027ETATCC＿RS158158?amino?7?oxononanoatesynthase1．026ETATCC＿RS01185sirohemesynthase1．001ETATCC＿RS07360gluconokinase-3．176ETATCC＿RS10185hypotheticalprotein-1．867ABCtransportersETATCC＿RS16605nickelABCtransporterATP?bindingprotein2．617ETATCC＿RS16615nickelABCtransporterpermeaseproteinNikB2．467ETATCC＿RS16600nickelABCtransporterATP?bindingproteinNikE2．348ETATCC＿RS16620nickelABCtransportersubstrate?bindingprotein2．129ETATCC＿RS16610nickelABCtransporterpermeaseproteinNikC2．055續(xù)表PathwayGeneIDGenedescriptionRNA?Seq?

ETATCC＿RS10370aminoacidABCtransportersubstrate?bindingprotein1．718ETATCC＿RS11635aminoacidABCtransporterATP?bindingprotein1．631ETATCC＿RS10375cysteineABCtransporterpermease1．505ETATCC＿RS07555thiamineABCtransporterpermease1．193ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS07595ironABCtransporterpermeaseABC1．012ETATCC＿RS04890aminoacidtransporter-1．216FlagellarassemblyETATCC＿RS11420flagellarproteinFliS-1．115ETATCC＿RS14855flagellarhookproteinFlgK-1．072ETATCC＿RS14860flagellarhookproteinFlgL-1．035MicrobialmetabolismindiverseenvironmentsETATCC＿RS10375cysteineABCtransporterpermease1．505ETATCC＿RS13205acidphosphatase1．313ETATCC＿RS04225hydrogenase2smallsubunit1．229ETATCC＿RS10905phosphonoacetaldehydehydrolase1．212ETATCC＿RS06430haloaciddehalogenase1．195ETATCC＿RS14735chorismatesynthase1．107ETATCC＿RS13645cytochromeCnitritereductase1．099ETATCC＿RS10525glyoxylatereductase1．080ETATCC＿RS09485putativeoxidoreductase1．074ETATCC＿RS04220hydrogenase1．048ETATCC＿RS02280succinyl?diaminopimelatedesuccinylase1．039ETATCC＿RS087253?mercaptopyruvatesulfurtransferase1．036ETATCC＿RS07510putativelong?chainfatty?acid?CoAligase1．014ETATCC＿RS04215putativeNiFe?hydrogenase2b?typecytochromesubunit1．011ETATCC＿RS01185sirohemesynthase1．001ETATCC＿RS04315thiosulfatesulfurtransferase1．000ETATCC＿RS06135citratelyasesubunitbeta-3．269ETATCC＿RS07360gluconokinase-3．176ETATCC＿RS061502?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephosphoCoAsynthase-2．423ETATCC＿RS10185hypotheticalprotein-1．867ETATCC＿RS070755?oxopent?3?ene?1，2，5?tricarboxylatedecarboxylase-1．156

Note：*RNA-seq，llog2 Ratio (eha_mutant_ET13/wild_ET13)l≥1.00

ABC轉(zhuǎn)運子(ABC transporter)是細菌膜上的一種運輸ATP酶，如寡肽透過酶(Oligopeptide permease，Opp)，控制著必需營養(yǎng)物質(zhì)進出細胞.在本研究中， 12個DEGs涉及該轉(zhuǎn)運路徑，編碼鎳、氨基酸、硫胺素、鐵等轉(zhuǎn)運蛋白。金葡菌Opp1ABC轉(zhuǎn)運子運輸鎳和鈷進入細胞,該突變子降低黏附小鼠膀胱和腎臟的能力,以及在泌尿道感染的模型中小鼠死亡率[10]。Et菌通過Eha調(diào)控這些基因的表達量以抵抗酸性環(huán)境的刺激，增加其在細胞內(nèi)的存活能力。

微生物次級代謝產(chǎn)物的合成通常以初級代謝產(chǎn)物為前體，并受其調(diào)節(jié)；次級代謝產(chǎn)物的合成過程易受環(huán)境因素的影響. 本研究發(fā)現(xiàn)17個DEGs涉及該路徑,均呈上調(diào)趨勢。ETATCC_RS10420和ETATCC_RS10415編碼的色氨酸合酶，沙眼衣原體的色氨酸合酶有助于它在Hela細胞內(nèi)的存活和對干擾素的抵抗力[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)ETATCC_RS11420、ETATCC_RS14855和ETATCC_RS14860分別編碼鞭毛蛋白FliC的分子伴侶FliS、鞭毛鉤絲FlgK和FlgL。FlgM-FliA回路在協(xié)調(diào)細菌鞭毛組裝中起關(guān)鍵作用。鞭毛是細菌的運動器官，鞭毛的運動方向受到細菌趨化作用系統(tǒng)的控制，鞭毛對于細菌的環(huán)境適應(yīng)性及致病性至關(guān)重要。在假結(jié)核耶爾森氏菌中，F(xiàn)liS作為分子伴侶通過調(diào)節(jié)FlgM的活性,調(diào)控后期鞭毛的表達、運動及生物膜形成(biofilm)[12]。生物膜是細菌為適應(yīng)自然環(huán)境，在生長過程中附著于固體表面而形成的特殊存在形式，生物膜的形成顯著增強了細菌對環(huán)境的抵抗能力。

不同環(huán)境中的微生物代謝路徑涉及多種物質(zhì)的代謝與降解過程，參與細菌物質(zhì)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)20個DEGs直接涉及該路徑，ETATCC_RS13205拷貝的酸性磷酸酶，能夠在酸性條件下水解磷酸酯鍵如酪氨酸磷酸酯酶，它可以作用于許多含酪氨酸磷酸的蛋白，這些蛋白涉及信號傳導(dǎo)。對于細菌來說，該酶和致病菌的毒力因子I和IV莢膜的合成有關(guān)，莢膜直接參與細菌對環(huán)境的抵抗能力[13]。

綜上所述，我們將RNA-seq技術(shù)首次用于Et菌的轉(zhuǎn)錄組研究。 Eha通過調(diào)控147個靶基因，影響Et的能量,代謝和毒力,以適應(yīng)其酸性環(huán)境。因此，在酸性生存環(huán)境，Eha對Et菌的轉(zhuǎn)錄組呈多途徑、多基因的適應(yīng)性的全局性調(diào)控,這些結(jié)果有助于探討 Eha調(diào)控Et抵抗巨噬細胞酸化的殺菌機制。

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Deep sequencing analysis on transcriptomes ofEdwardsiellatardaregulated by Eha following acidification

LIU Nian1，LI Yu-hong1,2，ZHENG En-jin1，GAO Da-qing1，LU Cheng-ping3

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.WuxiMedicineSchool，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China;3.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Our studies tried to demonstrate Eha (Et haemolysin activator) could regulate the resistance of the bacterium against acidification to survive in the macrophage and explain its underlying molecular mechanism. When the bacteria infected the macrophages at time intervals，intracellular survival rate in bafilomycin-treated macrophages was higher than that with untreated cells，and the rate of wild type ET 13 was higher than that of itsehamutant，respectively (P<0.05). The survival rate of the wild type was higher than that of the mutant under acid treatment (P<0.05). To determine the conditions that induced the highest eha expression，we constructed a pMP220-PehaLacZ plasmid and determined thelacZ expression under different conditions. After exposure of pH6.3 medium for 2 h time，we performed the whole transcriptomic profiles of the wild type and mutant by RNA-sequencing. We identified 147 differentially-expressed genes (|log2 ratio|≥1)，113 and 34 of which were significantly up-and down-regulated，respectively in the mutant，comparing with the wild type. These findings were validated by qRT-PCR. GO functional analysis revealed that these genes were divided into 25 categories，including the bacterial catalysis，cellular composition，combination，localization，metabolism，processing，and transportation. Based on the KEGG database，these genes were distributed in 55 pathways，such as two-component system，ABC transporters，and microbial metabolism in diverse environments. Overall，Eha is an important regulator to affect all kinds of target genes and pathways forE.tardato adapt to an acid environment. These results could be helpful for further investigations of the mechanisms by whichE.tardasurvives in macrophages.

ehagene; RNA-sequencing;Edwardsiellatarda; acidification

Gao Da-qing，Email: dgao2@seu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.001

國家自然科學(xué)基金(No.31570124)資助

高大慶:Email:dgao2@seu.edu.cn

1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210009； 2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，無錫 214122； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 21009

R378.2

A

1002-2694(2017)07-0575-08

2016-10-01 編輯：張智芳

Supported by the National Natural Science Foundation (No. 31570124)