劉寶山，趙芝娜，趙雨杰，王桂珍

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肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表達及鑒定

劉寶山1，趙芝娜2，趙雨杰3，王桂珍3

目的 探討肺炎支原體CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反應活性。方法 對CARDS毒素蛋白的抗原表位進行分析，選取10個重要的表位進行拼接，反向翻譯后合成并克隆，插入pET28a表達載體構(gòu)建pET-CARDS表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入受體菌。經(jīng)IPTG誘導表達的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His單克隆抗體和人陽性血清進行了免疫印跡的檢測。結(jié)果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表達載體構(gòu)建成功，誘導后表達大小為30KDa的重組蛋白，Western blot測定其能與6×His單克隆抗體和人陽性血清發(fā)生反應。結(jié)論 本研究選取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有較強的免疫活性，可為Mp感染的診斷提供新的候選抗原。

肺炎支原體；CARDS毒素蛋白；多表位拼接抗原；表達；鑒定

肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia，Mp)是社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原體，約占社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%，并呈增加趨勢[1]。其不但引起呼吸系統(tǒng)炎癥，而且與哮喘的發(fā)病密切相關，并可引起廣泛多系統(tǒng)肺外并發(fā)癥[2-3]。

近年來，一種被稱為社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征(community acquired respiratory distress syndrome，CARDS)毒素的抗原在Mp感染中的作用引起人們的關注。最新研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體毒力因子社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)是由MPN372基因編碼的591個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要分布于胞膜和胞質(zhì)，具有二核酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶活性[4]，依靠膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合真核細胞[5]，參與侵犯呼吸道等病理生理過程[6-7]，因而被認為是Mp的一個重要毒力因子。

2015年司文等在使用重組CARDS毒素蛋白診斷肺炎支原體感染的血清學ELISA試驗中，發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白，可作為Mp感染診斷的新抗原[8]，但比市售試劑盒的敏感性低。推測這可能是因為其分子量大(約70 kD)，包被時分子結(jié)合數(shù)量少，一些抗原表位可能會被阻擋，從而導致敏感度下降。為了克服這個缺點，尋找更加有效的抗原位點，提高檢測的敏感性，本研究對其候選抗原表位進行了拼接表達，為探討其抗原活性打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 pET28a(+)表達載體由本試驗室保存；其他試劑均為國產(chǎn)。

1.1.2 臨床標本來源 臨床肺炎支原體感染患者血清收集于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，抗體效價大于1∶40 (富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)的賽樂迪亞-麥可Ⅱ肺炎支原體抗體檢測試劑盒)。

1.2 方法

1.2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 根據(jù) GenBank中CARDS毒素蛋白 (MPNE_0433)的基因序列 (CP002077.1)，應用在線分析工具 TMHMM進行分析，選取目標抗原表位進行連接，使用大腸桿菌偏好密碼子進行反向翻譯后，交生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

1.2.2 CARDS重組表達載體的構(gòu)建 提取克隆重組質(zhì)粒和pET表達載體質(zhì)粒，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收CARDS拼接基因片段和線性pET28a載體，連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株。挑選克隆菌株進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，篩選得到 pET-CARDS陽性菌株。

1.2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導表達 pET-CARDS陽性菌株培養(yǎng)至OD600為0.5時，加入IPTG至1 μg/mL，誘導 pET-CARDS陽性菌株表達CARDS拼接蛋白，5 h后菌液采樣進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.4 免疫印跡鑒定 誘導菌和未誘導菌進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，分別使用6×His單克隆抗體和人肺炎支原體陽性血清作為一抗，使用HRP標記的蛋白G作為二抗進行免疫印跡，鑒定CARDS拼接蛋白的表達及免疫活性。

2 結(jié) 果

2.1 CARDS毒素蛋白基因的篩選 采用生物學軟件DNAMAN分析得到CARDS毒素蛋白的抗原表位(表1)，選擇具有親水性的抗原表位(斜體加粗)，使用linker(灰色底紋)進行連接，得到拼接蛋白序列：

將拼接蛋白和CARDS毒素蛋白經(jīng)SMART在線分析，表明兩個蛋白均含有Pfam: Pertussis _ S1結(jié)構(gòu)域，E-Value分別為4e-31和1.1e-126，具有高度的相似性。

然后采用大腸桿菌偏好密碼子進行反向翻譯，組成588 bp大小的基因序列：

將序列兩端分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

表1 CARDS毒素蛋白的抗原表位分析列表(斜體加粗為選取的抗原表位)

Tab.1 Analysis of antigenic epitopes of CARDS protein (Italics bold is selected)

No．StartpositionSequenceEndposition14PVRFVYRVDL13265LREYVPE71374RRAYLYE804102RQRQVVF1085122ALRTSFA1286138PIAAANVRSAWLVDAVPVE?PGHAHHPAGRVVE1697180NPHYQEL1868194PWLPTPGIATPVHLSIPQAAS?VAD217續(xù)表No．StartpositionSequenceEndposition9223SASLSFACPD23210243PLDKCIA24911256NLQSLPQYASSVKE26912271EDTPVYLRG27913295NNVFLVEV30214306QKSSFPQTIFFWDVYQRICLKD32715329TGAQISLSLTAFTT34216344YAGQLKVHLSVSAVNA35917369QDSAITQFRVSSEL38218400QHDLYVCPLK40919414DLEELQIIVDECTTHAQFVTM43420437ASTFFVDVQL44621450WRGYYYTPQLSG46122471GQIFYDLKTSKIFFV48523490NVFFLHN49624533LTIPSVEG54025542NFRHIRCYAD55126553QQLKVII55927579EDKILVK585

2.2 pET-CARDS表達載體的構(gòu)建 構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒進行酶切鑒定，出現(xiàn)600 bp的條帶，與預期結(jié)果相符(圖1)，表明表達載體構(gòu)建成功。

M：DL2000 Marker；1：restriction enzyme analysis圖1 質(zhì)粒酶切Fig.1 Restriction enzyme analysis

2.3 重組CARDS毒素蛋白的誘導表達 重組陽性菌株經(jīng)IPTG誘導后出現(xiàn)一條明顯的30 kD的蛋白條帶(圖2)，與預期重組蛋白大小一致，表明拼接蛋白得到表達。

M：Protein Marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria圖2 蛋白的誘導表達Fig.2 Induced expression

2.4 表達蛋白的免疫印跡鑒定 用6×His單克隆抗體進行免疫印跡分析，出現(xiàn)特異性的條帶(圖3A)。用人肺炎支原體陽性血清作為一抗進行免疫分析，在30 kD處也出現(xiàn)特異性的條帶(圖3B)。

A：WB by 6 HIS monoclonal antibody；B：WB by Human positive serum M：Protein marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria圖3 重組蛋白的免疫印跡Fig.3 Western-blot of rCARDS

3 討 論

Mp的CARDS 毒素蛋白由591個氨基酸構(gòu)成，其 N-末端為 ADP-核糖基化活化所必須，C-末端和完整的 CARDS毒素一樣有誘導哺乳動物細胞空泡化 (Vacuolization)的作用[4]。因此認為，CARDS毒素蛋白可能為Mp的毒力因子，參與Mp的增殖、接合，并與感染的持久化及呼吸道炎癥反應有關。2011年Peters等在難治性哮喘患者的血清標本檢測中發(fā)現(xiàn)，Mp陽性組、持續(xù)陽性組中 CARDS毒素和P1蛋白的IgM抗體顯著比Mp陰性組高，從而表明它們具有較好的免疫性，有希望能用來發(fā)展一種 Mp的診斷方法[9]。2013年Novella等檢測了相關肺炎患者支氣管灌洗液中的Mp CARDS毒素的核酸、蛋白及血清中的抗體，結(jié)果顯示，CARDS毒素DNA、蛋白及抗體的檢出率均高于P1蛋白，約40%的被檢者CARDS毒素分析陽性[10]。

Kannan等在Mp感染的實驗動物模型中，用重組CARDS毒素蛋白和P1黏附蛋白檢測感染小鼠血清中的抗體，兩種重組蛋白抗原檢測的抗體效價無明顯差異[2]。2015年司文等重組表達了CARDS毒素蛋白，對肺炎支原體感染血清的ELISA試驗，發(fā)現(xiàn)其敏感性高于重組P1蛋白，但檢測的敏感性仍低于商品試劑[8]。

為提高CARDS毒素蛋白作為包被抗原的敏感性，本研究將其候選抗原表位進行了拼接，表達后可以和肺炎患者的陽性血清發(fā)生反應，這提示其具有較好的反應原性，可純化后進行包被，比較敏感性的高低。

至于拼接蛋白的反應原性是某個抗原表位的作用，還是某些抗原表位的共同作用，以及哪個抗原表位起主導作用，尚需要進行進一步的研究。

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Expression and identification of recombinant chimeric CARDS ofMycoplasmapneumoniae

LIU Bao-shan1，ZHAO Zhi-na2，ZHAO Yu-jie3,WANG Gui-zhen3

(1.ShenyangAgricultureUniversity，Shenyang110866，China;2.ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China;3.ChinaMedicalUniversity，Shenyang110013，China)

We expressed multi-epitope chimeric protein of CARDS toxin protein ofMycoplasmapneumonia(Mp) in prokaryotic cells，and purified and investigated its immunoreactivity. A recombinant multi-epitope chimeric gene including ten critical epitopes was connected by linker and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+)，and transformed intoE.coliBL21(DE3) cells for expression under induction of IPTG. The antigenicity of expressed recombinant protein was identified with 6×His monoclonal antibody and human positive serum by Western blot. The recombinant expression vector pET-CARDS was constructed and the about 30 kDa recombinant chimeric protein expressed in BL21(DE3) successfully. Western blot analysis showed that it can react respectively with 6×His monoclonal antibodies and human positive serum. This study showed that the chimeric CARDS protein has an obvious immunoreactivity and a potential to be a new antigen for the diagnosis of Mp infection.

Mycoplasmapneumonia; CARDS toxin; chimeric; expression; identification

Wang Gui-zhen，Email: gzw004@126.com

遼寧省社會科學發(fā)展基金(No.20122225019)項目資助

王桂珍，Email:gzw004@126.com

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學，沈陽 110866； 2.沈陽藥科大學，沈陽 110016； 3.中國醫(yī)科大學，沈陽 110013

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.003

R375

A

1002-2694(2017)07-0588-04

2016-06-29 編輯：張智芳

Supported by the Department of Science and Technology of Liaoning Province (No. 20122225019)