風味蛋白酶和中性蛋白酶復合酶解大豆分離蛋白制備多肽的研究

馬詩文，高 云，吳金龍，郝曉亮

(遼寧科技大學化學工程學院，遼寧 鞍山 114051)

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風味蛋白酶和中性蛋白酶復合酶解大豆分離蛋白制備多肽的研究

馬詩文，高 云，吳金龍，郝曉亮

(遼寧科技大學化學工程學院，遼寧 鞍山 114051)

為了改善大豆蛋白的功能性質(zhì)，使其在食品工業(yè)中有更廣泛的應用，用酶來水解大豆蛋白，可以提高大豆多肽的產(chǎn)率。本研究以大豆分離蛋白作為底物，配制不同濃度的大豆分離蛋白溶液，經(jīng)預處理后，用風味蛋白酶、中性蛋白酶進行酶解，得出兩種酶的酶解最佳條件，即大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)為4%、風味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時間為7 h。在此條件下，溶液的水解度最高，經(jīng)測定多肽含量為5.162%。

大豆分離蛋白；水解度；酶；多肽

大豆蛋白是國際上公認的較理想的植物蛋白質(zhì)。多肽克服了大豆蛋白在營養(yǎng)學上的弱點，具有比大豆蛋白更豐富的營養(yǎng)和功能特性。大豆多肽已經(jīng)成為有效的輔助制劑，在發(fā)酵工業(yè)中，大豆多肽可以作為微生物的營養(yǎng)源，促進微生物生長和代謝；在食品工業(yè)中，大豆多肽可以應用于焙烤食品、糖果糕點和冷飲食品中，既降低了成本，也改善了產(chǎn)品的風味、口感和組織狀態(tài)等。目前制備大豆多肽的方法主要有微生物發(fā)酵法和酶解法，酶解法有單酶水解法、雙酶水解法以及復合酶酶解等方法。隨著研究的深入，人們逐漸認識到單酶水解法的不足，多酶復合水解法漸漸成為了研究的重點，且制得的產(chǎn)品性能普遍高于單酶水解法[1-4]。

本實驗采用大豆分離蛋白為原料，配成大豆分離蛋白溶液，用酶水解生成大豆多肽。風味蛋白酶和中性蛋白酶均為水解大豆蛋白的常見酶，多數(shù)研究只針對于兩種酶的單獨水解，對于這兩種酶的復配水解，相關的報道并不多。本研究將風味蛋白酶和中性蛋白酶進行復配，同時通過兩種酶的復配來比較酶的復配和單一酶對大豆分離蛋白作用的差異，尋求兩種酶的最佳配比。通過正交實驗設計，綜合比較選出大豆多肽最佳生產(chǎn)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(哈高科大豆有限責任公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為85.39%)；風味蛋白酶及中性蛋白酶(天津市諾奧科技發(fā)展有限公司，酶活分別為1.839 Ug/ml，2.352 Ug/ml)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DDY-2A凱式定氮儀，JA2003A電子天平，PHSJ-3F實驗室pH計，DHZ-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱，S212恒速攪拌器，722S可見分光光度計，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.3 大豆分離蛋白酶解工藝[5-9]

大豆分離蛋白→85℃保溫15 min→冷卻到酶適宜的溫度→調(diào)節(jié)pH值→放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)溫度→加入水解所需的酶→水解適當?shù)臅r間→取出酶解液迅速升溫到90℃并保持20 min滅酶→冷卻→4 000 r/min離心15 min→提取上清液→裝瓶冷藏備用。

1.4 水解度的測定

采用甲醛滴定法測定蛋白質(zhì)的水解度[10-11]。取大豆分離蛋白水解液2 ml于錐形瓶中，分別加入20 ml水，加入甲基紅指示劑3滴，用0.05 mol/L NaOH滴至橙黃色，加入40%中性甲醛溶液5 ml，加入酚酞指示劑3滴，再用0.05 mol/L NaOH滴至橙黃色,并記下用量V1。

將大豆分離蛋白用6 mol/L HCl，100℃水解2 h，使蛋白質(zhì)徹底水解。用上述方法測定，記下用去的0.05 mol/L NaOH的用量V2。

1.5 多肽含量的測定方法[12]

在酶解液中加入酸，調(diào)至蛋白質(zhì)的等電點，經(jīng)離心后，沉淀下來的是蛋白質(zhì)，而多肽及少量的氨基酸仍留在溶液中，由Folin-酚法測出上清液中的多肽含量。

2 結果與分析

2.1 單因素對酶解反應的影響

2.1.1 風味蛋白酶和中性蛋白酶的比例對酶解反應的影響

通過預實驗得知，在風味蛋白酶和中性蛋白酶進行復配時，風味蛋白酶起主要作用，因此，在做進一步實驗時加入了更多的風味蛋白酶以提高酶解效果。在前期研究中，筆者重點考察了底物質(zhì)量分數(shù)對大豆分離蛋白酶解的影響，最終認為4%的底物質(zhì)量分數(shù)對于水解是比較有利的，這與其他文獻報道的底物質(zhì)量分數(shù)是一致的[13-14]。在底物質(zhì)量分數(shù)為4%、溫度為45℃、時間為7 h、pH值為7.0時，取風味蛋白酶和中性蛋白酶比例為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1來考查復合酶配比對水解度的影響。由表1數(shù)據(jù)可知，當風味蛋白酶和中性蛋白酶的比例選取3∶1時，能取得較好的酶解效果。

表1 不同復合酶配比酶解的水解度值

2.1.2 pH值對酶解反應的影響

在底物質(zhì)量分數(shù)為4%、溫度為45℃、時間為7 h的條件下，pH值調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的情況下進行水解，完成后測定水解度見表2：

表2 不同pH值酶解的水解度值

由表2數(shù)據(jù)可以看出，水解度的值會隨著pH值的變化而不同，當處于堿性的時候，水解度會下降。兩種酶在pH值為7.0的時候，水解度較高，說明水解效果好?？赡苁且驗轱L味酶和中性酶等電點均在7.0左右，當pH值偏離了其等電點，在堿性條件下，溶液中多余的氫氧根離子可能會抑制水解反應的發(fā)生，影響酶對蛋白質(zhì)的水解效果。

2.1.3 溫度對酶解反應的影響

用風味蛋白酶、中性蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，在底物質(zhì)量分數(shù)為4%、時間為7 h、pH值為7.0的條件下，調(diào)節(jié)酶解溫度為40、45、50、55、60℃，測定水解度。

由表3可以看出，水解度的值會隨著溫度的變化有不同，過低的溫度使酶和蛋白質(zhì)的結合位點沒有被激活，不利于水解；過高的溫度會使酶變性，變性后的酶活性喪失，無法使蛋白質(zhì)水解。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，兩種酶在溫度為45℃的時候，水解度相對較高。

表3 不同溫度酶解的水解度值

2.1.4 酶解時間對酶解反應的影響

用風味蛋白酶、中性蛋白酶兩種酶對大豆分離蛋白進行水解，在底物質(zhì)量分數(shù)為4%、溫度為45℃、pH值為7.0的條件下，水解1、3、5、7、9、11 h，水解完成后測定水解度。水解度的值會隨著時間的延長而增大，但是當?shù)鞍踪|(zhì)底物逐漸消耗殆盡，酶對蛋白質(zhì)的水解停止。如表4所示，當時間為7 h時，水解已經(jīng)較完全。

表4 不同時間酶解的水解度值

2.2 雙酶復合法正交試驗

雙酶水解大豆分離蛋白正交試驗結果見表5。

表5 雙酶水解大豆分離蛋白正交試驗結果

由表5可知，各個因素對酶水解度影響從大到小為:酶解時間、酶解溫度、復合酶配比、pH值。雙酶酶解大豆分離蛋白的最佳工藝條件是A3B3C2D2。進行驗證實驗，選取風味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時間為7 h，得到的水解度為60.42%，高于正交實驗中的各條件下的水解，故此水解條件為最優(yōu)。

3 結論

通過單因素及正交實驗法確定雙酶酶解大豆分離蛋白的最佳工藝條件是底物質(zhì)量分數(shù)為4%、風味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時間為7 h，此時得到的溶液水解度最高，經(jīng)測定多肽質(zhì)量分數(shù)為5.162%，酶解后的大豆分離蛋白具有優(yōu)良的特性，可以進一步應用到食品工業(yè)中。

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(責任編輯：趙琳琳)

Preparation of polypeptide by cohydrolysis of soybean protein isolated with flavor protease and neutral protease

MA Shi-wen,GAO Yun,WU Jin-long,HAO Xiao-liang

(College of Chemical Engineering, University of Science and Technology LiaoNing, Anshan 114051, China )

In order to improve the functional properties of soybean protein and make it have more extensive application in food industry, the enzyme was used to hydrolyse soybean protein, which could improve the yield of soybean peptides. Using soybean protein isolated as the substrates, different concentrations solutions of soybean protein isolated were prepared, after pretreatment, flavor protease and neutral protease were digested with the solution, the optimum condition were acquired as:the solution concentration of soybean protein isolated was 4%, the ratio of flavor protease and neutral protease was 3∶1, the pH value was 7.5, the enzymolysis temperature was 45℃, the enzymolysis time was 7 h. Under this condition, the degree of hydrolysis of the solution was the highest, the polypeptide content was 5.162% by the experiment.

soybean protein isolated; degree of hydrolysis; enzyme; polypeptide

2017-02-04；

2017-06-23

遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410146000035)；遼寧省普通高等學校本科教育教學改革研究項目(UPRP20140453；2016-145)；遼寧省高等教育研究“十三五”規(guī)劃課題(課題編號：GHYB160159)；2016年遼寧科技大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(DC2016124)。

馬詩文(1995-)，女，本科，專業(yè)方向為食品生物技術。

郝曉亮(1980-)，男，講師，博士，研究方向為生物制藥及食品生物技術。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.07.011

TS201.2+1;TS 201.2+5

A

1003-6202(2017)07-0043-03