肇東鹽單胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆與功能分析

姜巨全，楊立娜，劉艷雙，孫開福

肇東鹽單胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆與功能分析

姜巨全，楊立娜，劉艷雙，孫開福

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

為探究一株中度嗜鹽菌-肇東鹽單胞菌（Halomonas zhaodongensis）NEAU-ST10-25T的耐鹽堿機(jī)制，采用基因文庫篩選方法從該菌株獲得一個(gè)重組質(zhì)粒pUC-LYS 1。該質(zhì)?？苫謴?fù)大腸桿菌（Escherichia coli）Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷株KNabc在含有0.2 mol·L-1NaCl的LBK培養(yǎng)基上生長。序列分析顯示，重組質(zhì)粒pUC-LYS1中外源DNA片段由1個(gè)N端截短的ORF1、三個(gè)完整的ORF（ORF2-4）以及1個(gè)C端截短的ORF5組成。其中，ORF4與伸長鹽單胞菌（Halomonas enlongata）中1個(gè)推測的胞苷酸激酶（Cytidylate kinase,CM K）同源性最高（86%）。為便于區(qū)分與其同源物，編碼ORF4的基因cmk來自肇東鹽單胞菌（Halomonas zhaodongensis）被定名為Hz_cmk。Hz_CMK也與包括已被鑒定來自大腸桿菌（E.coli）的Ec_CMK等其他同源物具有較高同源性。為進(jìn)一步鑒定Hz_cmk是否編碼胞苷酸激酶，通過PCR擴(kuò)增分別將Hz_cmk和大腸桿菌（E.coli）的同源基因Ec_cmk（作為正對照）構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET19，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE表明其以可溶形式存在。酶學(xué)分析表明Hz_CMK與Ec_CMK均具有較高胞苷酸激酶活性。為國內(nèi)外首次中度嗜鹽菌的胞苷酸激酶基因功能鑒定。

肇東鹽單胞菌；胞苷酸激酶（CMK）；原核表達(dá)；酶活性

核苷酸作為生物大分子，是構(gòu)成核酸重要原料，并作為能源物質(zhì)在生化反應(yīng)中起重要作用[1]。生物體合成核苷酸分為兩個(gè)途徑：一是從頭合成途徑，即細(xì)胞利用小分子物質(zhì)，經(jīng)多個(gè)酶促反應(yīng)，最終合成核苷酸。二是補(bǔ)救合成途徑，即利用細(xì)胞中游離堿基和核苷，經(jīng)簡單反應(yīng)生成核苷酸[2]。一些組織、細(xì)胞在缺乏從頭合成途徑所需原料時(shí)，僅能通過補(bǔ)救途徑合成核苷酸[3]。例如，嘧啶核苷酸可通過補(bǔ)救途徑產(chǎn)生，并產(chǎn)生共同產(chǎn)物UMP[4]。隨后，UMP磷酸化成UDP和UTP，進(jìn)一步完成CMP等其他嘧啶核苷酸合成[5]。在補(bǔ)救途徑合成嘧啶核苷酸過程中，核苷一磷酸激酶（NMK）可逆性催化三磷酸核苷的磷?；D(zhuǎn)移（通常ATP）至特定NMP上，是核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸代謝中關(guān)鍵酶[6]。在細(xì)菌中，胞苷酸激酶（CMK）是嘧啶核苷酸代謝關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，即催化CMP（dCMP）轉(zhuǎn)化為CDP（dC DP），ATP提供磷酸基團(tuán)，成為ADP[7]。CMK作為NMK家族一員，可減少CMP積累，通過產(chǎn)生CDP磷酸化生成CTP。CTP和dCTP是生物大分子RNA、DNA和磷脂合成前體[8-9]。在探索一株中度嗜鹽菌-肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T[10]耐鹽堿機(jī)制過程中，采用基因文庫與大腸桿菌（E.coli）Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷株KNabc[11]結(jié)合技術(shù)，克隆一個(gè)編碼胞苷酸激酶的基因Hz_cmk。研究發(fā)現(xiàn)該基因與肇東鹽單胞菌耐鹽堿機(jī)制有關(guān)，即可通過胞苷酸激酶（CMK）以補(bǔ)救途徑合成CMP，借助CTP和dCTP在磷脂合成中的作用，產(chǎn)生相容性物質(zhì)，具有耐鹽堿功能。本文對中度嗜鹽菌的胞苷酸激酶基因作功能鑒定，證實(shí)該基因編碼胞苷酸激酶，為揭示該基因耐鹽堿機(jī)制提供新思路并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒

肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T為本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定新種，保存于中國微生物菌種保藏中心（編號CGMCC 1.12286T）和德國微生物菌種保藏中心（編號DSM 25869T）；大腸桿菌（E.coli）KNabc由美國西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院Terry A. Krulwich教授贈(zèng)送，為一株Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ΔnhaA，ΔnhaB，ΔchaA）缺陷株。大腸桿菌（E.coli）DH5α、C41（DE3）、Trans-T1和感受態(tài)細(xì)胞以及T-A克隆載體pEasy T3試劑盒均購自北京全式金生物公司?？寺≥d體pUC18由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊蘇聲教授贈(zèng)送。原核表達(dá)載體pET19-pphistag（氨芐霉素抗性）由美國維克森林大學(xué)W. Todd Lowther教授提供，該載體由提供者在Qiagen公司購買原核表達(dá)載體pET19基礎(chǔ)上，在組氨酸殘基后加入一個(gè)PreScission Protease蛋白酶的酶切位點(diǎn)改造而成。

1.1.2 儀器

1.5 mL高速離心機(jī)（Thermo Scientific公司），5 mL高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司），50 mL高速離心機(jī)（Beckman公司），超低溫冰箱（Thermo Scientific公司），培養(yǎng)箱（上海志成生物公司），水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像儀，pH計(jì)（METTLER TOLEDO公司），高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），分光光度計(jì)（天津市普瑞斯儀器有限公司），電轉(zhuǎn)儀（Eppendorf公司），PCR儀（Ep?pendorf公司）。

1.1.3 藥品及試劑

1 kb DNA Ladder、DL2000，DNA MakerⅣ，RNaseA核糖核酸酶，IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），購自天根生物公司。DNA限制性內(nèi)切酶：Sau3AI、BamHⅠ、EcoRI，HindⅢ、NdeⅠ、Alkaline Phosphatase（CIAP）牛小腸堿性磷酸酶，購自TaKaRa生物公司。瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司。ATP，NADH，CMP，乳酸脫氫酶，丙酮酸激酶以及蛋白電泳所需試劑分別購自Roche、Biotopped、Tiangen等公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

改良的S-G培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨；5 g酵母浸出物；5 g酸水解酪蛋白；2 g KCl；3 g檸檬酸三鈉；20 g MgSO4·7H2O，30 g NaCl，pH 7.2～7.4。在制備固體培養(yǎng)基時(shí)加入1.5%瓊脂；肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T在液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、28℃振蕩培養(yǎng)24 h。

LBK培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，KCl 6.48 g，pH 7.0，部分試驗(yàn)中添加NaCl至所需濃度，或用Tris-HCl（pH 7～8.5）調(diào)至所需pH；大腸桿菌（E.coli）轉(zhuǎn)化子在含50μg·mL-1LBK平板上37℃培養(yǎng)，LBK液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、37℃培養(yǎng)24 h。

1.2方法

1.2.1 肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T中基因的克隆及序列分析

用Sau3AI酶對肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T基因組不完全酶切后，膠回收4～10 kb片段，與被BamHⅠ酶切并去磷酸化的pUC18載體連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至大腸桿菌（E.coli）KNabc感受態(tài)細(xì)胞中，最后在含有0.2 mol·L-1Na?Cl的LBK平板上篩選目的基因。

基因測序由北京華大基因股份有限公司完成。在NCBI上作核苷酸和氨基酸序列比對；用DNAman 6.0繪制質(zhì)粒圖譜并作序列酶切位點(diǎn)分析，核苷酸和氨基酸序列分析等；啟動(dòng)子序列預(yù)測借助網(wǎng)站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter. html完成。

1.2.2 熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增基因

根據(jù)重組質(zhì)粒pUC-LYS1中cmk基因序列和大腸桿菌（E.coli）K12基因組基因（負(fù)對照）序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由華大基因合成，引物序列見表1，其中：CATATG為NdeⅠ酶切位點(diǎn)；GGATCC為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。平末端加A后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 T-A克隆載體構(gòu)建

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T3克隆試劑盒說明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。藍(lán)白斑法挑取菌落白色的陽性克隆，提取質(zhì)粒，作PCR及雙酶切驗(yàn)證，基因測序由華大基因公司完成。

表1 Hz_cmk與Ec_cmk上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers of genes Hz_cmk and Ec_cmk

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建

提取質(zhì)粒pET19-pp-histag和T-A克隆重組質(zhì)粒，分別用NdeⅠ、BamHⅠ作雙酶切（100μL雙酶切體系：10×Buffer 10μL，質(zhì)粒50μL，NdeI 2μL，BamHⅠ2μL，ddH2O 36μL）。將雙酶切的pET19-pp-histag及目的基因片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，16℃過夜連接（連接方法按T4DNA連接酶使用說明書操作）。取適量連接體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。操作方法按大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）感受態(tài)細(xì)胞使用說明書操作。培養(yǎng)后挑取陽性重組子，待PCR及雙酶切驗(yàn)證正確后，送華大基因公司測序，最終確定Hz_cmk和Ec_cmk是否融合到表達(dá)載體histag開放閱讀框架（ORF）內(nèi)。

1.2.5 目的基因在大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有空載體pET19或目的基因重組表達(dá)載體的大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）分別接入50μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；將上述3種菌分別接入100 mL LB中，37℃培養(yǎng)2.5 h至OD600為0.6，取1 mL菌液作未誘導(dǎo)對照；添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，28℃誘導(dǎo)6 h。取1 mL上述3種菌液作為誘導(dǎo)后樣品；將剩余3種菌體用PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液清洗2次，重懸菌體，并加入PMSF、Triton X-100和適量DNAase；最后冰浴中超聲波破碎至菌液澄清（超聲具體參數(shù)為10%Hz，工作時(shí)間20 min，每次超聲2 s，間隔時(shí)間1.5 s）；取破碎液離心，收集上清及沉淀。上清作為可溶性蛋白樣品，沉淀用等體積緩沖液重懸，作為不可溶性蛋白樣品。以上所有樣品用于SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測。

1.2.6 肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）中胞苷酸激酶（CMK）活性測定

測定CMK活性方法為雙酶分析法[12]，原理如下：

其中，pyruvate-丙酮酸；lactic acid-乳酸；PK pyruvate kinase-丙酮酸激酶；LDH lacate dehy?drogenase-乳酸脫氫酶。NADH在340 nm有最強(qiáng)吸收峰，可根據(jù)反應(yīng)前后NADH含量變化，間接計(jì)算CMK活性。

具體步驟為：混合NADH各管溶液，測定各管溶液在340 nm處吸光值，制定NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)酶活力定義在5 mL離心管中加入3 mL反應(yīng)體系，體系包含：100μmol·L-1CMP，1.5 mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4），5 mmol·L-1KCl，0.2 mmol-1PEP，0.2 mmol-1NADH，pyruvate kinase 1.5 U，lactate dehydrogenase 1.5 U，1.0 mmol·L-1ATP，加入適量CMK粗酶液；37℃反應(yīng)1 h，98℃水浴5 min終止反應(yīng)。作3個(gè)平行重復(fù)；調(diào)零，測定不加入CMK粗酶液反應(yīng)體系的A340吸光值，再測定加入CMK粗酶液反應(yīng)體系在0和60 min時(shí)的A340吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1陽性克隆篩選

Sau3AI不完全酶切NEAU-ST10-25T基因組后，膠回收4～10 kb片段，與被BamHI酶切并去磷酸化的pUC18載體連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至大腸桿菌（E.coli）KNabc感受態(tài)細(xì)胞中，最后在含有0.2 mol·L-1NaCl的LBK培養(yǎng)基中篩選，獲得一個(gè)重組質(zhì)粒，命名為pUC-LYS1。

2.2pUC-LYS1中外源DNA片段序列分析

如圖1所示，重組質(zhì)粒pUC-LYS1中外源DNA片段長6 772 bp，由1個(gè)N端截短ORF1、3個(gè)完整ORF（ORF2-4）及1個(gè)C端截短ORF5組成。其中，N端截短的ORF1（1～948）長947 bp；ORF2（956～2045）長1 089 bp；ORF3（2059～4366）長2 307 bp；ORF4（4 358～5 045）長687 bp；截短ORF5（5 234～6772）長1 538 bp。經(jīng)過比對，N端截短的ORF1與鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）TD 01中3-磷酸絲氨酸/磷酸羥基蘇氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（3-phosphoserine/phos?phohydroxythreonine aminotransferase）同源性最高（93%）；ORF2與南極堿鹽單胞菌（H.alkaliantarcti?ca）中預(yù)苯酸脫水酶（Prephenate dehydratase）同源性最高（97%）；ORF3與南極堿鹽單胞菌（H.alkaliant?arctica）中雙功能的預(yù)苯酸脫氫酶/3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯轉(zhuǎn)移酶（Bifunctional prephenate dehydroge?nase/3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase）同源性最高（94%）；ORF4與伸長鹽單胞菌（H.en?longata）中胞苷酸激酶（cytidylate kinase,CMK）同源性最高（86%），為便于區(qū)分其同源物，編碼ORF4的基因cmk因其來自肇東鹽單胞菌（H.zhaodongen?sis）被定名為Hz_cmk。；C端截短的ORF5與湛江鹽單胞菌（H.zhanjiangensis）中核糖體蛋白S1（30S ri?bosomal protein S1）同源性最高（99%）。

2.3Hz_CMK的氨基酸序列分析及同源性比較

如圖2A所示，Hz_CMK含229個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量24,610.9，等電點(diǎn)pI 5.62。在Hz_CMK氨基酸組成中，以Ala殘基含量最高（35/229），其次分別為Leu（30/229）、Arg（21/229）、Asp（18/229）、Gly（16/229），Asn、His、Trp、Met含量較低。

圖1 重組質(zhì)粒pUC-LYS1中外源DNA片段結(jié)構(gòu)Fig.1 Mapping of the inserted DNA fragment in the recombinant plasmid pUC-LYS 1

圖2 肇東鹽單胞菌胞苷酸激酶Hz_CMK的氨基酸序列及其同源性比對Fig.2 Deduced amino acid sequence of cytidylate kinase,Hz_CMK,from Halomonas zhaodongensis, together with alignment of Hz_CMK with its homologs

同源性比對分析表明，Hz_CMK與伸長鹽單胞菌（H.enlongata）中推測的He_CMK同源性最高（86%）。符合Hz_cmk克隆自鹽單胞菌屬（Halomonas）的事實(shí)。由于He_CMK為推測蛋白，將Hz_CMK與其他已鑒定CMK蛋白作同源比對。結(jié)果如圖2B所示，Hz_CMK與來自大腸桿菌（E.coli）的Ec_CMK、來自霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的Vc_CMK、來自枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）的Bs_CMK和來自結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的Mt_CMK同源性分別為55%、52%、39%和37%。根據(jù)同源性比對結(jié)果，可初步判斷Hz_cmk編碼胞苷酸激酶。

2.4Hz_cmk和Ec_cmk克隆載體和表達(dá)載體構(gòu)建

分別以重組質(zhì)粒pUC-LYS1和大腸桿菌（E.coli）K12基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增Hz_cmk與Ec_cmk基因，通過T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物克隆至pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞獲得陽性克隆，經(jīng)測序驗(yàn)證二者均與原序列一致。為驗(yàn)證兩個(gè)基因是否具有胞苷酸激酶功能，將Hz_cmk與Ec_cmk構(gòu)建至表達(dá)載體pET19-pphistag，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切及測序驗(yàn)證，Hz_cmk與Ec_cmk均成功融合到表達(dá)載體histag開放閱讀框架（ORF）內(nèi)。轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的大腸桿菌（E.coli）C41（DE3），分別命名為C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk。轉(zhuǎn)入空載體pET19-pp-his-tag的大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）命名為C41（DE3）/ pET19。

2.5Hz_cmk和Ec_cmk在大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)

為鑒定Hz_cmk和Ec_cmk是否表達(dá)，分別IPTG誘導(dǎo)C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/ pET-Ec_cmk，并在誘導(dǎo)前后取樣，將樣品與相應(yīng)細(xì)胞破碎后上清和沉淀樣品作SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE顯示，C41（DE3）/pET-Hz_cmk（圖3A）和C41（DE3）/pET-Ec_cmk（見圖3B）在28 ku附近均出現(xiàn)一條明顯粗帶，與預(yù)測Hz_CMK或Ec_CMK蛋白的分子質(zhì)量28 ku接近，表明Hz_cmk和Ec_cmk基因在大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）中被高效誘導(dǎo)表達(dá)。此外，在C41（DE3）/pET-Hz_cmk（圖3A）或C41（DE3）/pET-Ec_cmk（見圖3B）細(xì)胞破碎后上清液中出現(xiàn)同樣大小且濃度相近粗帶，表明誘導(dǎo)表達(dá)的Hz_CMK或Ec_CMK蛋白大部分可溶，證明在大腸桿菌（E.coli）C41（DE3）中異源表達(dá)后，Hz_CMK或Ec_CMK蛋白正確折疊且具有活性。

圖3 Hz_cmk與Ec_cmk在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白可溶性分析Fig.3 Expression and solubility analysis of Hz_cmk and Ec_cmk in E.coli C41(DE3)

2.6胞苷酸激酶酶活測定

用雙酶分析法測定胞苷酸激酶活性，NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4A）。測定反應(yīng)過程中NADH在340 nm處吸光值，通過曲線計(jì)算NADH含量。最后間接計(jì)算胞苷酸激酶活性。為鑒定Hz_cmk是否編碼胞苷酸激酶，利用C41（DE3）/pET19細(xì)胞提取物作為負(fù)對照，C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物作為正對照，測定C41（DE3）/pET-Hz_cmk細(xì)胞提取物酶活性。如圖4B所示，與C41（DE3）/pET19（負(fù)對照）細(xì)胞提取物未檢測到胞苷酸激酶活性，C41（DE3）/pET-Hz_cmk細(xì)胞提取物檢測到與C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物（正對照）相似酶活性，表明Hz_cmk編碼胞苷酸激酶。為進(jìn)一步確定該結(jié)果，試驗(yàn)選取含不同量C41（DE3）/pETHz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物，在相同反應(yīng)時(shí)間測定胞苷酸激酶酶量對該酶反應(yīng)速率影響。結(jié)果表明，隨細(xì)胞提取物增加，胞苷酸激酶活性顯著提高，且在酶量400μg時(shí)，酶活性達(dá)到飽和（見圖4C），進(jìn)一步證實(shí)Hz_cmk編碼胞苷酸激酶。

圖4 胞苷酸激酶酶學(xué)分析Fig.4 Enzymatic analysis for cytidylate kinase

3 討論與結(jié)論

在大腸桿菌（E.coli）、霍亂弧菌（V.cholerae）、枯草芽胞桿菌（B.subtilis）和結(jié)核分枝桿菌（M.tuber?culosis）等非嗜鹽菌中，胞苷酸激酶（CMK）已被鑒定為嘧啶核苷酸代謝關(guān)鍵酶，在生物大分子RNA，DNA和磷脂合成中具有重要作用[8-9]。在探索一株中度嗜鹽菌-肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEA U-ST10-25T耐鹽堿機(jī)制過程中，采用基因文庫與大腸桿菌（E.coli）Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷株KNabc[11]結(jié)合技術(shù)，克隆一個(gè)編碼胞苷酸激酶的基因Hz_cmk。本文基因Hz_cmk的克隆與功能鑒定結(jié)果證實(shí)，該基因編碼胞苷酸激酶。為國內(nèi)外首次報(bào)道中度嗜鹽菌胞苷酸激酶基因克隆與功能分析。

目前，CMK活性測定多采用分光光度法，總反應(yīng)式為：CMP+PEP+NADH CDP+lactic acid+ NAD+。在整個(gè)反應(yīng)體系中，除含有CMK外，包括PK和LDH，又稱雙酶分析法[12]。NADH在340 nm下有特征吸收峰，反應(yīng)中NADH被氧化為NAD+，可通過檢測NADH含量反映CMK酶活性。為驗(yàn)證該方法可靠性，本文利用C41（DE3）/pET19細(xì)胞提取物作為負(fù)對照，C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物作為正對照。通過驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)C41（DE3）/ pET19（負(fù)對照）細(xì)胞提取物未檢測到胞苷酸激酶活性，而C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物（正對照）檢測到較高酶活性，表明該方法切實(shí)可行。C41（DE3）/pET-Hz_cmk細(xì)胞提取物檢測到與C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物（正對照）相似酶活性，表明Hz_cmk編碼胞苷酸激酶。由于酶活性僅為特定酶量下的酶學(xué)分析，結(jié)果可靠性需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本文取不同含量C41（DE3）/pET-Hz_cmk和C41（DE3）/pET-Ec_cmk細(xì)胞提取物，在相同反應(yīng)時(shí)間測定胞苷酸激酶酶量對該酶反應(yīng)速率影響。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞提取物增加，胞苷酸激酶活性顯著提高，酶量400μg時(shí)，酶活性達(dá)到飽和，證實(shí)Hz_cmk編碼胞苷酸激酶。

目前，仍未見胞苷酸激酶參與細(xì)菌耐鹽堿過程相關(guān)報(bào)道，僅發(fā)現(xiàn)胞苷酸激酶催化CMP生成CDP，產(chǎn)物CDP可能參與細(xì)菌體內(nèi)諸如磷脂合成等代謝途徑[8-9]。在鹽脅迫下，甘氨酸甜菜堿可影響微生物體內(nèi)離子分布，穩(wěn)定脅迫下微生物體內(nèi)大分子，調(diào)節(jié)微生物對鹽脅迫環(huán)境適應(yīng)[13-14]。磷脂酰膽堿已被證實(shí)參與磷脂合成途徑，該物質(zhì)為甘氨酸甜菜堿前體物質(zhì)，推測Hz_CMK可能通過合成CDP參與磷脂合成，影響甘氨酸甜菜堿合成量實(shí)現(xiàn)肇東鹽單胞菌（H.zhaodongensis）NEAU-ST10-25T對鹽堿響應(yīng)。今后將通過基因敲除方法，敲除磷脂合成途徑等有關(guān)基因，研究分析其突變株合成甘氨酸甜菜堿量變化，以驗(yàn)證Hz_CMK是否通過合成CDP參與磷脂合成產(chǎn)生耐鹽堿作用。

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Cloning and functional analysis of cmk encoding cytidylate kinase in Halomonas zhaodongensis/

JIANG Juquan,YANG Lina,LIU Yanshuang,SUN Kaifu
(SchoolofLife Sciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China)

In order to explore the halo-alkaline-tolerant mechanism of the moderate halophile Halomonas zhaodongensis NEAU-ST10-25T,genomic DNA was screened from this strain by selection in Escherichia coli KNabc lacking three major Na+/H+antiporters.One recombinant plasmid designated pUC-LYS1 enabled E.coli KNabc to grow in the presence of 0.2 mol·L-1NaCl. Sequence analysis showed that one N-terminal ORF1,three intact ORF(ORF2-4)and one C-terminal ORF5 are included in the DNA sequence inserted in the recombinant plasmid pUC-LYS1.Of three intact ORFs,ORF4 had the highest identity of 86%with a putative cytidylate kinase(CMK)from Halomonas enlongata.For the convenience of differentiation of its homologs,the gene cmkencoding ORF4 from H.zhaodongensis was designated Hz_cmk.Hz_CMK has also the higher identity with its homologs including the identified Ec_CMK from E.coli.In order to determine whether it encodes a cytidylate kinase,Hz_cmk,as well as Ec_cmk from E.coli as a positive control, was respectively constructed into a prokaryotic expression vector,pET19,and then transformed into the competent cells of E.coli C41(DE3),followed by the induction by with isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG).SDS-PAGE showed that Hz_CMK or Ec_CMK was overexpressed in E. coli C41(DE3)and soluble analysis also showed that either of them is present mostly in a soluble form,revealing that Hz_CMK or Ec_CMK should be functional in E.coli.Finally, enzymatic assay showed that Hz_CMK,as well as Ec_CMK,displayed the cytidylate kinase activity.To the best of our knowledge,this is the first report on the cloning and functional analysis of the cytidylate kinase gene from the moderate halophile.

Halomonas zhaodongensis;cytidylate kinase(CMK);prokaryotic expression; enzymatic activity

Q933

A

1005-9369（2017）07-0033-08

時(shí)間2017-7-12 11:19:42[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170712.1119.010.html

姜巨全,楊立娜,劉艷雙,等.肇東鹽單胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆與功能分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(7):33-40.

Jiang Juquan,Yang Lina,Liu Yanshuang,et al.Cloning and functional analysis of cmk encoding cytidylate kinase in Halomonas zhaodongensis[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(7):33-40.(in Chinese with English abstract)

2017-05-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31570045）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C201417）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金（LBHQ14022）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)與生物技術(shù)制藥。E-mail：jjqdainty@163.com