周 華， 姜科聲， 黃巧麗， 陳藝成， 李彥明， 李 濤

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310031；3.河南大學(xué) 附屬淮河醫(yī)院，河南 開封 475000)

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來氟米特對前列腺癌PC3細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

周 華1， 姜科聲1， 黃巧麗1， 陳藝成2， 李彥明3， 李 濤1

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310031；3.河南大學(xué) 附屬淮河醫(yī)院，河南 開封 475000)

為了研究來氟米特(LEF)對前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，采用前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3與不同濃度的來氟米特(0,50,100,150 μmol5L-1)共培養(yǎng)(24,48,72 h)，通過CCK-8細(xì)胞活力檢測實(shí)驗和克隆形成實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)來氟米特抑制PC3細(xì)胞增殖，且存在明顯的濃度時間依賴性；流式細(xì)胞檢測表明,來氟米特使PC3細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，并且促進(jìn)其凋亡；當(dāng)來氟米特濃度≥150 μmol5L-1時，Western Blot實(shí)驗檢測到Caspase-3蛋白發(fā)生剪切活化.來氟米特處理可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞自噬，采用羥氯喹抑制自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示自噬增強(qiáng)了細(xì)胞抗凋亡能力.研究表明，來氟米特可抑制PC3細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可能對前列腺癌有潛在的治療作用.

來氟米特；前列腺癌；增殖；凋亡；自噬

老藥新用是藥物研發(fā)的有效途徑之一，同時老藥亦可作為先導(dǎo)藥物，通過充分揭示其結(jié)構(gòu)-藥效關(guān)系，進(jìn)一步衍生、開發(fā)新型藥物.來氟米特(Leflunomide,LEF)是一種人工合成的小分子異噁唑類化合物，具有抗增殖及免疫抑制作用，在臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及防治移植物抗宿主反應(yīng).基于LEF是已獲批準(zhǔn)上市的藥物，臨床應(yīng)用中尚未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重毒副反應(yīng)，因此,發(fā)掘其潛在的藥理效應(yīng)、拓展其應(yīng)用范圍具有重要的實(shí)際價值.

來氟米特在細(xì)胞內(nèi)代謝為丙二酸次氮酰胺(A771726)，從而發(fā)揮藥效.A771726能可逆地抑制二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)的活性.DHODH是嘧啶從頭合成過程中的關(guān)鍵限速酶，A771726對DHODH的抑制導(dǎo)致細(xì)胞嘧啶合成障礙，從而限制了細(xì)胞增殖.來氟米特及其代謝產(chǎn)物A771726在低濃度時主要通過對DHODH的抑制發(fā)揮增殖拮抗作用，此作用可以被外源添加的嘧啶所逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的恢復(fù)[1-2].

近來發(fā)現(xiàn)，來氟米特可通過旁路途徑影響細(xì)胞增殖，在較高濃度時其增殖抑制作用不受外源嘧啶的干擾.已發(fā)現(xiàn)來氟米特和A771726可以抑制 NF-κB的激活，下調(diào)NF-κB 調(diào)控的TNF，IL-1和VEGF等炎性及增殖基因的表達(dá)[3].來氟米特及A771726在高濃度時可以抑制許多受體蛋白的表達(dá)或干擾受體酪氨酸激酶的活性，這一類受體包括多個生長因子的受體如EGF,TGF及PDGF受體，它們在腫瘤中多呈現(xiàn)高豐度表達(dá)，與腫瘤的快速擴(kuò)增、侵襲及預(yù)后有關(guān).來氟米特抑制這些受體所具有的蛋白酪氨酸激酶活性，干擾細(xì)胞增殖刺激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤治療方面具有重要的應(yīng)用價值[1,4-6].目前，已發(fā)現(xiàn)來氟米特對乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤等惡性腫瘤都具有明顯的抑制效果,但對前列腺癌等腫瘤的作用還缺少細(xì)致的研究.本研究以PC3細(xì)胞為研究對象，在體外研究了來氟米特對前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所.來氟米特和羥氯喹(HCQ)購自Sigma公司.Cell Counting Kit-8(CCK-8)，Annexin V/PI apoptosis kit凋亡檢測試劑盒和Cell cycle kit周期檢測試劑盒均購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染色液、Western Blot試劑盒、抗β-actin抗體、苯甲基磺酰氟(PMSF)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)、Protein Ladder和PVDF膜均購于碧云天.細(xì)胞培養(yǎng)皿、Eppendorf管、15 mL或50 mL離心管、96孔或6孔培養(yǎng)板均購自美國Corning.0.25% Trypsin & 0.02% EDTA胰酶，RPML1640培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司.四季青胎牛血清購自浙江天杭生物技術(shù)有限公司；RIPA中性裂解液購于上海威奧生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購于Thermo公司；Caspase-3和LC3抗體購于CST公司.EZ-ECL購于BI公司.

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

PC3細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)于RPML1640+10%胎牛血清+100 U5mL-1青霉素和100 μg5mL-1鏈霉素的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗.

1.3 CCK-8細(xì)胞活力檢測

胰酶消化對數(shù)生長的PC3細(xì)胞，制成密度為1.5×104mL-1的單細(xì)胞懸液，每孔種3×103個細(xì)胞于96孔細(xì)胞板內(nèi)，每組設(shè)6個復(fù)孔.參照文獻(xiàn)[7]的來氟米特劑量濃度，待細(xì)胞貼壁后，加入200 μL含來氟米特終濃度為50，100和150 μmol5L-1的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞對照組只加入等量二甲基亞砜(0.1%)，空白組只加入等量的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，將細(xì)胞板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，在酶標(biāo)儀上讀取A450的數(shù)值，按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞活力的影響：

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖時相分布

PC3細(xì)胞以1.5×105mL-1的密度接種于6孔板上，24 h貼壁后，加入終濃度為50，100和150 μmol5L-1來氟米特的完全培養(yǎng)基，每組各3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期采用Cell Cycle Kit試劑盒.收集原細(xì)胞培養(yǎng)液(含全部懸浮細(xì)胞)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用收集的原細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞全部移至15 mL離心管中，800 r/min×5 min離心，去除上清,收集2×105～1×106個細(xì)胞用PBS重懸，再次800 r/min離心5 min，去除上清，用1 mL試劑A和10 μL試劑B重懸細(xì)胞，室溫孵育30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測.

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

PC3細(xì)胞以1.5×105mL-1的密度接種于6孔板中，來氟米特共培養(yǎng)48 h,采用Annexin V/PI apoptosis kit試劑盒檢測細(xì)胞凋亡.收集原細(xì)胞培養(yǎng)液(含全部懸浮細(xì)胞)，PBS 洗滌貼壁細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用收集的原細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞全部移至15 mL離心管中，800 r/min×5 min離心，去除上清,PBS洗滌一次，收集1×105～5×105個細(xì)胞，用500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI試劑，室溫下避光孵育5 min,即上機(jī)檢測.

1.6 蛋白印跡

細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，按1 mL RIPA中性裂解液加10 μL PMSF的比例加入適量裂解液，冰上孵育30 min后，細(xì)胞刮刀收集至離心管中，4 ℃，12 000 r/min×20 min離心沉淀細(xì)胞，上清即為全細(xì)胞裂解液,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量.20 μg蛋白煮沸后，12% SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育1～2 h后化學(xué)發(fā)光法顯色.

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗

用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化對數(shù)生長的PC3細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按每孔1×103個細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板上,實(shí)驗組細(xì)胞分別給予50，100和150 μmol5L-1來氟米特，對照組加0.1%二甲基亞砜，十字型交叉晃動培養(yǎng)基，使細(xì)胞分散均勻，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d,棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，甲醇固定15 min,棄固定液，0.1%結(jié)晶紫染色10～20 min后用PBS緩慢洗去染液，晾干拍照.

1.8 統(tǒng)計方法

采用Graphpad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用SPSS18.0進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析,P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 來氟米特對PC3細(xì)胞增殖的影響

倒置顯微鏡下觀察，正常狀態(tài)下的PC3細(xì)胞貼壁生長，呈不規(guī)則長梭形，多角形，上皮樣，邊緣光滑，立體感強(qiáng)，具有折光性.分別用不同濃度的來氟米特處理48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，表現(xiàn)為隨著來氟米特濃度的增大，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞間隙變大，體積變小，細(xì)胞皺縮，變細(xì)長，呈纖維狀生長，漂浮的細(xì)胞增多，并有變圓等凋亡形態(tài)改變(見圖1(a)).用CCK-8法檢測來氟米特對PC3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，隨著劑量增加和作用時間延長，來氟米特對PC3細(xì)胞增殖的抑制作用表現(xiàn)出時相性和量效依賴性(見圖1(b)和(c)).

(a)細(xì)胞明場圖

(b)細(xì)胞活力隨LEF濃度的變化 (c)細(xì)胞活力隨時間的變化

2.2 來氟米特對PC3細(xì)胞周期的影響

為了進(jìn)一步確定細(xì)胞增殖抑制發(fā)生在哪一環(huán)節(jié)，用不同濃度的來氟米特處理PC3細(xì)胞24 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測.結(jié)果顯示，隨著來氟米特濃度的增加，S期細(xì)胞比例明顯增加，G1期和G2/M期細(xì)胞比例則相應(yīng)減少(見圖2(a)和(b))，提示細(xì)胞發(fā)生S期阻滯.

2.3 來氟米特對PC3細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是影響細(xì)胞活力的另一重要事件.不同濃度的來氟米特處理PC3細(xì)胞48 h，通過Annexin V-PI雙染流式分析發(fā)現(xiàn)，隨著來氟米特濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例逐漸增高.結(jié)果顯示：150 μmol5L-1劑量組早期凋亡和晚期凋亡的比例分別是11.59%和4.88%；而50 μmol5L-1劑量組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例分別是3.15%和3.18%；100 μmol5L-1劑量組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例分別是6.58%和6.75%(見圖3(a)).

(a)流式細(xì)胞周期圖(FL2-A)

(b)細(xì)胞周期分布

(a)Western Blot分析Caspase-3的表達(dá)

(b)Annexin V-FITC和PI雙染流式檢測細(xì)胞凋亡

Caspase-3在細(xì)胞凋亡中具有重要的作用，Caspase-3的裂解表示Caspase-3的活化，能夠比較敏感地反應(yīng)細(xì)胞的凋亡程度.蛋白印跡檢測顯示，與對照組相比，Caspase-3的裂解隨來氟米特濃度的增加而增加，提示高劑量的來氟米特促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡(見圖3(b)).

2.4 來氟米特對PC3細(xì)胞自噬的影響

在饑餓、低氧、藥物等因素作用下，細(xì)胞會發(fā)生自噬，自噬與凋亡共同調(diào)控細(xì)胞死亡.某些情況下，自噬抑制凋亡，是細(xì)胞的存活途徑；同時，自噬本身也會誘發(fā)細(xì)胞凋亡，或與凋亡共同作用調(diào)控細(xì)胞死亡.本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的來氟米特處理均會觸發(fā)細(xì)胞自噬，導(dǎo)致胞漿型LC3-Ⅰ剪切成為膜型LC3-Ⅱ(見圖4(a)).而使用羥氯喹(HCQ)抑制自噬聯(lián)合處理，則有效地增加了細(xì)胞的凋亡率(見圖4(b)).這一結(jié)果表明，來氟米特觸發(fā)的自噬發(fā)揮了抗凋亡的作用.

2.5 來氟米特對PC3細(xì)胞克隆形成能力的影響

克隆形成實(shí)驗再次證明，來氟米特對PC3細(xì)胞具有抑制增殖的作用.將1×103個細(xì)胞種植在6孔板中，用二甲基亞砜作為對照，用含不同濃度來氟米特的培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，用結(jié)晶紫染色觀察克隆形成率.結(jié)果顯示，與對照組相比較，隨著來氟米特濃度的增大，克隆體積變小、數(shù)量變少(見圖5).

(a)Western Blot分析LC3蛋白剪切

(b)Annexin V-FITC和PI雙染流式檢測細(xì)胞凋亡

LEF處理7 d，結(jié)晶紫染色圖5 來氟米特使PC3細(xì)胞克隆形成能力下降

3 討 論

本實(shí)驗以PC3細(xì)胞為對象，探討了來氟米特對前列腺癌細(xì)胞的影響.實(shí)驗表明：來氟米特可以抑制PC3細(xì)胞增殖，并且具有時間-濃度依賴性，可使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；同時，來氟米特可以促進(jìn)PC3細(xì)胞的凋亡.本實(shí)驗同時發(fā)現(xiàn)，低劑量的來氟米特即可誘發(fā)PC3細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制自噬發(fā)生會增強(qiáng)來氟米特的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng).

來氟米特作為一種低毒、高效的新型免疫調(diào)節(jié)藥，主要用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療和抗移植排斥反應(yīng)，在病毒感染等其他領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用[8-12].來氟米特及其活性代謝物A771726的主要作用機(jī)理是抑制嘧啶從頭合成途徑第4步反應(yīng)中的關(guān)鍵酶DHODH的活性，以非競爭的方式阻斷嘧啶合成，從而發(fā)揮抗增殖作用.正常細(xì)胞除了從頭合成途徑外還有補(bǔ)救合成途徑，即利用細(xì)胞外的嘧啶堿基來合成細(xì)胞代謝所需的嘧啶核苷酸.來氟米特只能通過抑制DHODH的活性抑制嘧啶從頭合成途徑，但對補(bǔ)救途徑?jīng)]有影響.腫瘤細(xì)胞可通過補(bǔ)救途徑來滿足細(xì)胞代謝對嘧啶核苷酸的需求.

但來氟米特還存在不依賴DHODH抑制的其他途徑來影響細(xì)胞增殖和凋亡.研究發(fā)現(xiàn)，來氟米特可顯著抑制NF-κB活化，從而發(fā)揮抗炎抗纖維化的作用，并可藉此抑制CMV和BK等病毒的復(fù)制[12].此外，研究發(fā)現(xiàn)，高劑量來氟米特或其代謝物A771726可抑制多個酪氨酸激酶系統(tǒng)(如PDGFR，EGFR和JAK3)、絲/蘇氨酸激酶系統(tǒng)(AKT,p70S6K1和PDK1)，降低細(xì)胞對細(xì)胞因子、絲裂原等的反應(yīng)[1,4-6].來氟米特對DHODH及增殖相關(guān)激酶系統(tǒng)的抑制，表明其在腫瘤治療中有一定的應(yīng)用潛力.文獻(xiàn)[13]在研究來氟米特抑制白血病細(xì)胞株K562生長機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，來氟米特消耗細(xì)胞內(nèi)的嘧啶核苷酸(UTP和CTP)，從而使細(xì)胞停止在S期.還有研究表明，來氟米特能誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞[14]、慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞[15]、鼠白血病細(xì)胞[16]、人骨髓瘤細(xì)胞[17]和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[7]發(fā)生G0/G1或S期阻滯.在這些研究中，來氟米特的作用跟劑量有關(guān)，不同劑量對細(xì)胞的增殖和凋亡有不同的影響.高劑量的來氟米特會顯著誘導(dǎo)骨髓瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7,17].

Hail等[18]在研究來氟米特對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)WR-1E和DU-145抑制生長和促凋亡機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，來氟米特抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞的增殖.有趣的是，高劑量來氟米特增強(qiáng)ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡.本實(shí)驗使用前列腺癌PC3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)來氟米特濃度≥100 μmol5L-1時PC3細(xì)胞發(fā)生明顯的S期增殖阻滯，150 μmol5L-1處理下PC3細(xì)胞才發(fā)生明顯的凋亡作用，即：來氟米特在低劑量下主要誘導(dǎo)增殖阻滯，對凋亡影響較小；高劑量條件下，來氟米特可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.本研究發(fā)現(xiàn)，來氟米特誘導(dǎo)的自噬是阻礙細(xì)胞凋亡的重要因素，因而自噬抑制劑可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對來氟米特的敏感性.來氟米特的特性提示其更適合與其他藥物搭配，通過不同的拮抗機(jī)理達(dá)成聯(lián)合用藥效應(yīng)，用于腫瘤的預(yù)防和治療.

總之，本研究表明來氟米特對前列腺癌具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，需要進(jìn)一步研究其作用機(jī)制.同時，前列腺癌也存在不同的分型，包括雄激素依賴型和非依賴型等，因此，進(jìn)一步揭示對來氟米特敏感的具體腫瘤亞型也是很有必要的，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計出針對前列腺癌的更佳的治療藥物.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

The effects of Leflunomide on cellular proliferation and apoptosis in PC3 cells

ZHOU Hua1, JIANG Kesheng1, HUANG Qiaoli1, CHEN Yicheng2, LI Yanming3, LI Tao1

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.SirRunRunShawHospitalofZhejiangUniversity,Hangzhou310031,China; 3.HuaiheHospitalofHe′nanUniversity,Kaifeng475000,China)

Leflunomide (LEF), an immunosuppressive drug, was generally used in the treatment of rheumatoid arthritis. Recently, increasing evidences indicated that LEF had an effective anti-proliferative effect on various tumors. To investigate the effect of LEF in prostatic cancer cells, prostatic cancer cell line PC3 was treated with solutions of LEF (0, 50, 100 and 150 μmol5L-1) and cultured in varied duration of time (24, 48 and 72 h). CCK-8 and cell clone forming experiments showed that when the concentration was ≥ 150 μmol5L-1, LEF significantly inhibited cell growth in a time- and dose-dependent manner. Annexin V-FITC/PI staining assay revealed that LEF induced S-phase cell cycle arrest, and enhanced cell apoptosis via modulation of Caspase-3 expression as shown by Western blotting experiments. Moreover, LEF could induce autophagy of PC3 cells, while hydroxychloroquine (HCQ) could enhance LEF-induced apoptosis by inhibiting autophagy. Taken together, LEF inhibited proliferation and promoted apoptosis of the PC3 cells.

Leflunomide; prostatic cancer; proliferation; apoptosis; autophagy

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.01.012

2016-01-07；

2016-05-17

國家自然科學(xué)基金資助項目(31101057；31470082；81101929)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY14C120001)；浙江省公共創(chuàng)新平臺實(shí)驗動物項目(2014C37126)；浙江省衛(wèi)生廳創(chuàng)新平臺項目(2015RCA014)

周 華(1991-)，女，河南信陽人，碩士研究生.研究方向：動物細(xì)胞生物學(xué).

李 濤.E-mail: litao@zjnu.cn

Q291

A

1001-5051(2017)01-0079-06