賀宗毅，張德利，李 黎，邢康康，陳仕江*

冬蟲夏草線狀菌體制劑對蝠蛾幼蟲感染的研究

賀宗毅1,2,3,4，張德利1,2,3,4，李 黎1,4，邢康康1,2,3,4，陳仕江1,2,3,4*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市中藥資源學重點實驗室，重慶 400065；3.中國中醫(yī)科學院，中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；4.甘孜州康定貢嘎中華蟲草產(chǎn)業(yè)有限責任公司，四川甘孜 626000)

為明確冬蟲夏草線狀菌體制劑的侵染力，進行了冬蟲夏草線狀菌體制劑對蝠蛾幼蟲的感染試驗。在相同條件下對蝠蛾幼蟲進行人工接種，并對感染溫度、菌劑用量和蟲齡進行了優(yōu)化。結(jié)果表明冬蟲夏草線狀菌體具有侵染蝠蛾幼蟲的能力，優(yōu)化后的感染條件為：菌體劑量為5 g(即5個標準劑量)、幼蟲蟲齡為3齡、培養(yǎng)溫度為14 ℃。該結(jié)果為蝠蛾幼蟲新型接種體的制備與開發(fā)提供了依據(jù)。

冬蟲夏草菌；線狀菌體；蝠蛾幼蟲；感染

冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.(Sungetal.,2007)系我國特產(chǎn)珍稀名貴中藥材，是冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis侵入蝠蛾屬Hepialus.幼蟲體內(nèi)后形成的一種菌物藥(Weietal., 2006)，被譽為國菌(Zhangetal., 2015)，具有補肺益腎、止血化痰之功效(Bhushanetal., 2013)。

冬蟲夏草野生資源匱乏，不能滿足市場需求，因此開展冬蟲夏草人工繁育勢在必行。蝠蛾幼蟲接種技術(shù)體系是冬蟲夏草人工繁育中的關(guān)鍵技術(shù)之一(Heetal., 2016)，而蝠蛾幼蟲被侵染的關(guān)鍵是有效的接種菌劑。目前接種菌劑來源主要有冬蟲夏草菌的分生孢子和冬蟲夏草菌絲體，分生孢子體作為菌劑報道較多(Lietal., 2013, 2016；Zhangetal., 2016)。由于冬蟲夏草菌是極為特殊的一種高原嗜低溫型真菌，其生長周期長、生長速度慢、產(chǎn)孢條件苛刻、極易染菌，且冬蟲夏草菌多次傳代菌種退化嚴重(Lvetal., 2016)，菌劑危機顯現(xiàn)，阻礙了冬蟲夏草人工培殖的產(chǎn)業(yè)化，在蝠蛾幼蟲接種菌劑領(lǐng)域?qū)で笮碌耐黄凭哂兄匾饬x。冬蟲夏草線狀菌體作為蝠蛾幼蟲新的菌劑應(yīng)用具有培養(yǎng)條件較易、產(chǎn)量高、易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，且已有成功誘導(dǎo)線狀菌體形成和菌劑制備的報道(Liuetal., 2008；Heetal., 2016)，但用線狀菌體制備的菌劑對蝠蛾幼蟲的侵染效果未見報道。為明確線狀菌體菌劑對蝠蛾幼蟲的侵染效果，本研究測定了冬蟲夏草線狀菌體菌劑對蝠蛾幼蟲侵染的影響，以期為蝠蛾幼蟲新型接種菌劑的制備與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis菌種，保存于重慶市中藥研究院。

供試蟲種：蝠蛾幼蟲為貢嘎蝠蛾HepialusgonggaensisFu et Huang幼蟲，尹定華研究員鑒定。

主要儀器設(shè)備：奧林巴斯CX23顯微鏡；ZHWY-200B恒溫搖床購自上海智誠；UV-1605型紫外可見分光光度計購自島津；TDL-40B高速離心機購自上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1D超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；GZX-9070數(shù)顯鼓風干燥箱購自上海博迅實業(yè)有限公司設(shè)備廠；電冰箱購自合肥榮事達電冰箱有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高壓滅菌鍋購自上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 冬蟲夏草菌線狀菌體菌劑的制備

冬蟲夏草菌線狀菌體的誘導(dǎo)培養(yǎng)：按文獻(Heetal., 2016)中所述方法進行培養(yǎng)。

冬蟲夏草菌線狀菌體的制備：在超凈工作臺中將發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液過三號藥典篩，棄去固形物，得濾液；再將濾液過九號藥典篩，取固形菌體，分散，備用。

線狀菌體菌劑的制備：參考文獻(Liuetal., 2009)制備法，經(jīng)改良后：取10 mL菜籽油和4 mL鄰苯二甲酸二丁酯于20 mL試管中，加入司班-80 50 μL/mL、硬脂酸鋁60 mg/mL，再取上述冬蟲夏草線狀菌體1 g混入，經(jīng)充分攪拌分散后混勻，制得1個標準劑量菌種制劑。

1.2.2 蟲源飼養(yǎng)

幼蟲為人工室內(nèi)繁育貢嘎蝠蛾HepialusgonggaensisFu et Huang幼蟲。蝠蛾成蟲交尾后，移至產(chǎn)產(chǎn)卵箱中，待其產(chǎn)卵后收集變黑的卵粒，將卵粒平鋪于保濕濾紙上后保溫孵化，幼蟲孵化后挑取幼蟲至飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng)(飼養(yǎng)盒中平鋪珠芽蓼、人參果、圓穗蓼、胡蘿卜等飼料)，定期檢查并更換飼料。本試驗中選取2-3齡幼蟲進行試驗(除齡期考察外)。

1.2.3 感染率的測定

取標準劑量菌種制劑若干，選取齡期一致的貢嘎蝠蛾幼蟲，采用浸漬法接種(Fengetal., 1990)，每次選取30頭供試幼蟲，浸漬10 s，然后取出，用滅菌后的干濾紙吸去蟲體表面殘余的懸浮液，放入13℃、濕度60%培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次，每7天觀察記錄幼蟲體內(nèi)是否有蟲菌體形成，以此計算幼蟲感染率(φ)：

1.2.4 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理

單因素實驗：首先對影響感染效果的因素分別進行了單因素試驗。顯著性分析采用多重比較得出，同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示數(shù)據(jù)存在顯著差異，同一列數(shù)據(jù)若含有相同字母表示不存在顯著差異。數(shù)據(jù)采用spss 19.0軟件進行差異顯著性分析。

正交實驗：為優(yōu)化感染條件及感染效果，將單因子實驗的因素指標進行正交實驗考察。各因素選取水平情況、試驗結(jié)果及分析。顯著性分析采用數(shù)據(jù)采用spss 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同齡期幼蟲對侵染效果的影響

幼蟲免疫活性與幼蟲發(fā)育時期具有相關(guān)性(Wuetal., 2010)，其體壁附著菌劑的能力和被菌體分泌的胞外酶降解的程序亦不同(Pengetal., 2009)，為了解較適宜的幼蟲侵染齡期，在其它條件一致的情況下，分別考察了不同齡期幼蟲對感染率的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同齡期幼蟲感染效果Table 1 The results of instar on Hepialus moths larva infection

注：多重比較顯著性檢驗水平，同一行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:The different letters indicate there were significant differences (P<0.05).

由表1可得知，幼蟲齡期不同，其感染率相差較大。隨著幼蟲的生長，感染率逐漸上升，3齡幼蟲時達到最高感染率26.7%，顯著優(yōu)于其它齡期的侵染率(P<0.05)。隨著幼蟲進一步生長老熟，感染率有所下降。1齡和5齡幼蟲未檢測出被感染的幼蟲，可能是較嫩或老熟幼蟲不利于菌劑感染。

2.1.2 菌體劑量對蝠蛾幼蟲侵染效果的影響

分別考察了不同菌體用量配制的菌劑對蝠蛾幼蟲侵染效果的影響，其它條件相同，結(jié)果見圖2。

表2 菌體劑量對蝠蛾幼蟲侵染效果的影響Table 2 The effect of filamentous mycelium biomass on Hepialus moths larva infection

注：多重比較顯著性檢驗水平，同一行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。表2-3同。Note:The different letters indicate there were significant differences (P<0.05).Same to Table 2-3.

實驗菌劑所用菌體線狀、質(zhì)輕、分支多、易扭結(jié)團聚，因此需用助懸試劑將菌絲分散開來，較多的菌種用量雖可增加侵染的機率，但過多的菌體易發(fā)生扭結(jié)、團聚，影響侵染率。從表2可看出，菌體用量增大會提高幼蟲的感染率，當線狀菌體用量為4 g時，其感染率顯著優(yōu)于其它菌種用量的效果(P<0.05)。隨著菌體用量繼續(xù)增加，線狀菌體在分散劑中出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，進而影響了感染率。故配制菌劑時菌體用量為4 g(即4個標準劑量)。

2.1.3 溫度對侵染效果的影響

冬蟲夏草菌來源于高原特有生物冬蟲夏草，冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)平均溫度長年低于20 ℃，其對溫度較敏感(Xingetal., 2008)。因此進行菌體制劑感染實驗時對溫度的篩選極其重要。其它條件相同，分別研究了不同溫度條件下菌體制劑對蝠蛾幼蟲感染效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 溫度對蝠蛾幼蟲侵染效果的影響Table 3 The effect of temperature on Hepialus moths larva infection

隨著溫度的升高菌體頂端生長萌發(fā)較快，感染率逐漸升高，當溫度超過16℃時蝠蛾幼蟲出現(xiàn)生長受阻，能檢測到蟲菌體的幼蟲越來越少，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，說明溫度的升高影響到蝠蛾幼蟲生理生長。當培養(yǎng)溫度為14℃時，幼蟲感染率顯著優(yōu)于其它溫度培養(yǎng)下的效果(P<0.05)，故選擇14℃作為培養(yǎng)溫度。

2.2 正交實驗

在明確菌體制劑具有侵染力的情況下，為確定主影響因子和較優(yōu)的侵染條件，對不同齡期幼蟲、菌種用量、侵染溫度3個因素進行了正交實驗優(yōu)化。根據(jù)單因素中3個因素的試驗結(jié)果進行L4(23)正交實驗。各因素選取水平情況見表4，試驗及分析結(jié)果見表5。

表4 正交實驗因素水平Table 4 The factor level oforthogonal experiment

表5 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 5 The orthogonal experiment design and results

注：表中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)平均值±標準差。Note: SE, Data in the same column with different capital.

從表5中的結(jié)果可表明：培養(yǎng)溫度是影響蝠蛾幼蟲感染率的最顯著因素，其余兩個因素的顯著性影響程度依次為：幼蟲蟲齡>菌體劑量。影響蝠蛾幼蟲感染率的最佳條件組合為：A2B1C2，即菌體劑量為5 g(即5個標準劑量)，幼蟲蟲齡為3齡，培養(yǎng)溫度為14℃。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明具有活性的線狀菌體制劑對蝠蛾幼蟲具有侵染力，優(yōu)化確定了影響蝠蛾幼蟲感染率的主因素并獲得了最優(yōu)培養(yǎng)條件：菌體劑量為5 g(即5個標準劑量)、幼蟲蟲齡為3齡、培養(yǎng)溫度為14℃。

冬蟲夏草侵染及形成過程極其復(fù)雜，現(xiàn)有研究雖表明冬蟲夏草菌是冬蟲夏草的唯一無性型菌種(Shenetal., 1983；Liuetal., 1989；Lietal., 2000)，但在學術(shù)界仍存在較大爭議。如近年來研究認為在冬蟲夏草成熟過程中，冬蟲夏草菌與蝙蝠蛾擬青霉存在DNA共存及競爭性生長，表明冬蟲夏草是蝙蝠蛾擬青霉和冬蟲夏草菌共同的結(jié)果(Zhuetal., 2007；Yangetal., 2008；Gaoetal., 2011；Zhuetal., 2012)。在冬蟲夏草分子生物學研究領(lǐng)域不斷有新的證據(jù)證實野生冬蟲夏草是多種真菌、多種突變基因型冬蟲夏草菌與蝠蛾幼蟲形成的物種復(fù)合體，是可培養(yǎng)真菌以及更多不可培養(yǎng)真菌形成的菌物群區(qū)系(Zhangetal., 2010a, 2010b)。

本試驗研究結(jié)果表明線狀菌體制劑對蝠蛾幼蟲雖有感染力，但感染率均較低，未達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求，今后工作將重點關(guān)注于如何提高侵染率。由于整個實驗仍處在冬蟲夏草高原產(chǎn)區(qū)和使用滅菌土培的形式飼養(yǎng)，在部分環(huán)節(jié)中是否存在其它土棲真菌或因子的干預(yù)，有待進一步確定。同時，線狀菌體是如何侵入幼蟲體內(nèi)及侵入期間、侵入后幼蟲自身存在何種形態(tài)的免疫應(yīng)答等科學問題則有待進一步的研究。

References)

Gao L, Li XH, Zhao JQ,etal.Detection of multipleOphiocordycepssinensismutants in premature stroma ofCordycepssinensisby Massarray SNP MALDI-TOF mass spectrum genotyping [J].JournalofPekingUniversity(Health Sciences), 2011, 43 (2): 259-266.[高凌, 李曉紅, 趙建晴, 等.MassARRAY單核苷酸多態(tài)性MALDI-TOF質(zhì)譜基因分型法檢測未成熟冬蟲夏草子座中多個冬蟲夏草菌突變基因型[J].北京大學學報(醫(yī)學版), 2011, 43 (2): 259-266]

He ZY, Li L, Zhang DL,etal.The research on the proliferative culture ofOphiocordycepssinensisfilamentous mycelium [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2016, 38 (6): 1205-1213.[賀宗毅, 李黎, 張德利, 等.冬蟲夏草菌絲狀菌源增殖培養(yǎng)的研究[J].環(huán)境昆蟲學報, 2016, 38 (6): 1205-1213]

Lei YY, Lv LH, He YR,etal.Correlation between biological characteristics ofBeauveriabassianaand its virulence toPlutellaxylostella[J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2010, 26 (2): 143-148.[雷妍圓, 呂利華, 何余容, 等.球孢白僵菌生物學特性與其對小菜蛾致病力相關(guān)性分析[J].中國生物防治, 2010, 26 (2): 143-148]

Li JH, Xie F, Wang C,etal.The microstructure and formation of the conidia ofHirsutellasinensis[J].ChineseJournalofMicroecology, 2013, 25 (7): 775-781.[李建宏, 謝放, 王燦, 等.中國被毛孢分生孢子形成過程顯微結(jié)構(gòu)的研究[J].中國微生態(tài)學雜志, 2013, 25 (7): 775-781]

Li YL, Luo HC, Hu M.Research on the artificial cultivation of the conidia byOphiocordycepssinensis[J].FoodResearchandDevelopment, 2016, 37 (3): 187-190.[李玲玲, 羅合春, 胡敏.人工培育冬蟲夏草分生孢子的研究[J].食品研究與開發(fā), 2016, 37 (3): 187-190]

Liu HB, Wang GX, Mao XB,etal.Optimization on oil suspension formulation ofCordycepssinensisspawn [J].Microbiology, 2009, 36 (10): 1557-1563.[劉洪波, 王貴學, 毛先兵, 等.正交優(yōu)化冬蟲夏草菌種油混懸制劑[J].微生物學通報, 2009, 36 (10): 1557-1563]

Liu HB, Wang GX, Zhu HL,etal.The microstructure and formation of the conidia ofHirsutellasinensis[J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2008, (s1): 106-110.[劉洪波, 王貴學, 朱華李, 等.冬蟲夏草菌種油混懸劑的研究[J].中國生物防治學報, 2008, (s1): 106-110]

Peng GL, Xue JW, Liu WM,etal.Role of protease chitinase ofVerticilliumlecaniiin infecting scale insect cuticle[J].ChineseJournalAppliedandEnvironmentalBiology, 2009, 15 (2): 220-225.[彭國良, 薛皎亮, 劉衛(wèi)敏, 等.蠟蚧輪枝菌入侵蚧蟲表皮過程中蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的作用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學報, 2009, 15 (2): 220-225]

Shen NY, Zeng L, Zhang XC,etal.The separation ofOphiocordycepssinensisfungi [J].EdibleFungi, 1983, 5 (1): 1-5.[沈南英, 曾璐, 張顯恥, 等.冬蟲夏草真菌的分離[J].食用菌, 1983, 5 (1): 1-5]

Shrestha B, Zhang WM, Zhang YJ,etal.What is the Chinese caterpillar fungusOphiocordycepssinensis(Ophiocordycipitaceae) [J].Mycology, 2010, 1 (4): 228-236.

Wei XL, Yin XC, Guo YL,etal.Analyses of molecular systematics onCordycepssinensisand its related taxa [J].Mycosystema, 2006, 25 (2): 192-202.[魏鑫麗, 印象初, 郭英蘭, 等.冬蟲夏草及其相關(guān)類群的分子系統(tǒng)學分析 [J].菌物學報, 2006, 25 (2): 192-202]

Wu BS.The Difference of Immunocomptence during Development in the Mealworm Beetles,Tenebriomolitor(Insecta Coleptera) [D].Suzhou: Suzhou University, 2010.[吳必順.黃粉蟲發(fā)育過程中免疫活性差異研究[D].蘇州: 蘇州大學, 2010]

Xing XK, Guo SX.The structure and histochemistry of sclerotia ofOphiocordycepssinensis[J].Mycologia, 2008, 100 (4): 616-625.

Yang JL, Xiao W, He HX,etal.Molecular phylogenetic analysis ofPaecilomyceshepialiandCordycepssinensis[J].ActaPharmaceuticaSinica, 2008, 43 (4): 421-426.[楊金玲, 肖薇, 何惠霞, 等.蝙蝠蛾擬青霉與冬蟲夏草關(guān)系的分子系統(tǒng)學研究[J].藥學學報, 2008, 43 (4): 421-426]

Zhang YJ, Li EW, Wang CS,etal.Ophiocordycepssinensis, the flagship fungus of China: Terminology, life strategy and ecology [J].Mycology, 2012, 3 (1): 2-10.

Zhang YJ, Sun BD, Zhang S,etal.Mycobiotal investigation of naturalOphiocordycepssinensisbased on culture-dependent investigation [J].Mycosystema, 2010a, 29 (4): 518-527.[張永杰, 孫炳達, 張姝, 等.分離自冬蟲夏草可培養(yǎng)真菌的多樣性研究[J].菌物學報, 29 (4): 518-527]

Zhang YJ, Zhang S, Wang M,etal.High diversity of the fungal community structure in naturally occurringOphiocordycepssinensis[J].PLoSONE, 2010b, 5 (12): 1-8.

Zhang ZY, Liang GH, Liang L,etal.Effects of medium and environmental conditions on the sporulation ofOphiocordycepssinensisin solid fermentation [J].Mycosystema, 2016, 35 (4): 440-449.[張宗耀, 梁關(guān)海, 梁蕾, 等.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對冬蟲夏草固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的影響[J].菌物學報, 2016, 35 (4): 440-449]

Zhu JS, Guo YL, Yao YS,etal.Coexistence ofHirsutellasinensisandPaecilomyceshepialiDNA during maturation ofCordycepssinensisand changes in fungal competitive proliferation capability and chemical profiles [J].JournalofFungalResearch, 2007, 5 (4): 214-224.[朱佳石, 郭英蘭, 姚藝桑, 等.冬蟲夏草成熟過程中冬蟲夏草和蝙蝠蛾擬青霉DNA共存及競爭增殖力、化學成分變化[J].菌物研究, 2007, 5 (4): 214-224]

Zhu JS, Zhao JG, Gao L,etal.Dynamically altered expressions of at 6Ophiocordycepssinensismutants in the stroma ofCordycepssinensis[J].JournalofFungalResearch, 2012, 10 (2): 100-112.[朱佳石, 趙家剛, 高凌, 等.至少6個突變基因型冬蟲夏草菌在冬蟲夏草子座中表達的動態(tài)變化[J].菌物研究, 2012, 10 (2): 100-112]

The infection research on theOphiocordycepssinensisfilamentous mycelium toHepialusmoths larvae

HE Zong-Yi1,2,3,4，ZHANG De-Li1,2,3,4，LI Li1,4，XING Kang-Kang1,2,3,4，CHEN Shi-Jiang1,2,3,4*

(1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China; 2.Chongqing Key Laboratory of Chinese Medicine Resources, Chongqing 400065, China; 3.Chongqing Sub-center of the National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Chongqing 400065, China; 4.Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Kangding GonggaOphiocordycepssinensisIndustry CO.LTD., Ganzi 626000, Sichuan Province, China)

In order to clear the infection of theOphiocordycepssinensisfilamentous mycelium to theHepialusmoths larvae, the infection ofO.sinensisfilamentous mycelium toHepialusmoths larvae was tested by artificial fed at the same environment and condition.Then, the infected conditions were optimized by orthogonal experiment design.The results showed that the infected conditions were amount ofO.sinensisfilamentous mycelium 5 g, instar 3th, temperature 14℃, In summery, theO.sinensisfilamentous mycelium had the infection to theHepialusmoths larvae.The result had provided theoretical basis to the reforming ofO.sinensisfilamentous mycelium inoculant preparation.

Ophiocordycepssinensis; filamentous mycelium;Hepialusmoths larva; infect

賀宗毅，張德利，李黎,等.冬蟲夏草線狀菌體制劑對蝠蛾幼蟲感染的研究[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(3):673-678.

重慶市科技平臺項目(cstc2014ptyjd10001)；重慶市科技惠民計劃項目(2013gs500102-D2014-3)；重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(cstc2015shmszx120032)；重慶市科技攻關(guān)計劃項目(cstc2013yykfB110002)

賀宗毅，男，1986年生，重慶人，碩士研究生，助理研究員，研究方向為冬蟲夏草人工培殖，E-mail: cqhcmthzy2004@163.com

*通迅作者Author for correspondence，E-mail:shijiangchen@163.com

Received: 2017-03-10；接受日期Accepted: 2017-04-10

Q965

A

1674-0858(2017)03-673-06