高夢穎 黃惠娟 謝樹紅

1. 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建 福州 350000 2. 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福建 福州 350025

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之首，其臨床病理種類繁多，惡性程度高，且具有起病隱匿、癌細(xì)胞擴(kuò)散快速、手術(shù)及化療藥物療效不盡人意等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著女性健康及生存質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球約有20萬人患上卵巢癌，其中12.5萬人死于此病[1]。根據(jù)最新國際癌癥研究中心公布的“2015年全球癌癥數(shù)據(jù)庫”(GLOBOCAN 2015)[2]資料顯示，卵巢癌引起的死亡率占女性腫瘤的5%，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌患者術(shù)后因體內(nèi)雌激素水平急劇下降，骨質(zhì)疏松及骨折等并發(fā)癥的發(fā)病率亦隨之增高。骨質(zhì)疏松癥是以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的一種代謝性全身性病。立足于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，橄欖苦苷可通過提高大鼠的骨密度來防止骨量的流失，達(dá)到延緩或防治骨質(zhì)疏松的目的，此結(jié)果亦在防治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的臨床研究中得到證實(shí)[3-4]。但是橄欖苦苷是否與破骨細(xì)胞的增殖凋亡有關(guān)，目前國內(nèi)尚沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用 400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL的橄欖苦苷作為藥物刺激因子，觀察不同時(shí)間及不同濃度橄欖苦苷對體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株由福建中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供；小鼠重組可溶性核因子KB活因子受體配體(sRANKL，Peprotech公司)、小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF，Peprotech公司)、橄欖苦苷(購于 Funakoshi，Tokyo，Japan)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物公司)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(GENVIEW公司)；高糖 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone公司)、10%胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、15 mL、50 mL離心管(HyClone公司)。

1.2 方法

1.2.1蓋玻片處理：用玻璃刀把蓋玻片割成1 cm×1 cm大小，濃酸浸泡過夜，自來水沖洗10 min，蒸餾水沖洗3 min，然后浸泡于無水乙醇中2 h脫脂，用鑷子取出在超凈臺(tái)中晾干，用前高壓滅菌。

1.2.2破骨細(xì)胞誘導(dǎo)：將裝有RAW264.7細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，迅速投入37 ℃水浴，800 r/min離心5 min，棄上清，以含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸后，接種到24孔板中的預(yù)置無菌玻片上，細(xì)胞接種密度2×104個(gè)/cm2；12 h待細(xì)胞貼壁后，換為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(含50 ng/mL sRANKL和30 ng/mL M-CSF)，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。誘導(dǎo)6 d后倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.2.3破骨細(xì)胞鑒定：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：避光配制TRAP孵育液，并于37 ℃水浴箱中加熱10 min。在玻片上培養(yǎng)6 d的破骨細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，加固定液于37 ℃恒溫箱中固定25 min，PBS沖洗2次，加入配制好的孵育液內(nèi)，將玻片放入37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h，然后用蘇木素復(fù)染3 min，PBS沖洗1次，在倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。

1.2.4CCK8法測定細(xì)胞增殖：將誘導(dǎo)成功的破骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，第2天吸去培養(yǎng)液后，加入含有不同濃度橄欖苦苷(400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)液200 μL繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，用CCK8法測定破骨細(xì)胞OD值。

1.2.5乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定：LDH作為一種酶，參與機(jī)體能量代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)。通過檢測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞外環(huán)境中LDH的含量，可以評價(jià)細(xì)胞膜完整性。將誘導(dǎo)成功的破骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，第2天吸去培養(yǎng)液后，加入含有不同濃度橄欖苦苷(400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)液200 μL繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書進(jìn)行LDH活性測定。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞的鑒定

經(jīng)50 ng/mL sRANKL和30 ng/mL M-CSF誘導(dǎo)6 d后，RAW264.7細(xì)胞被誘導(dǎo)成為圓形、橢圓形、水煎蛋型等多型態(tài)的多核細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞周圍有偽足。經(jīng)TRAP染色后，高倍鏡下觀察見細(xì)胞呈鮮紅色樣，有多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞核不著色，可見核仁，胞漿內(nèi)富含深紅色酸性磷酸酶顆粒。見圖1。

圖1 TRAP染色結(jié)果，染色陽性且細(xì)胞核在3個(gè)以上者即為破骨細(xì)胞，圖中線條長度為100 μmFig.1 Result of TRAP staining. Cells with positive staining and 3 or more nucleus are osteoclasts. The bar length is 100 μm

2.2 橄欖苦苷對破骨細(xì)胞增殖的影響

2.2.124 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的影響：與空白對照組(Control，Con)比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL 橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，50 μg/mL橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時(shí)對破骨細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.248 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的影響：與空白對照組比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中橄欖苦苷濃度為200 μg/mL時(shí)對破骨細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.372 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的影響：與空白對照組比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，50 μg/mL的橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時(shí)對破骨細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.4不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度對破骨細(xì)胞增殖情況的整體影響：與空白對照組比較，在不同時(shí)間點(diǎn)中400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；50 μg/mL的橄欖苦苷只在藥物作用48 h對破骨細(xì)胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物作用時(shí)間為24 h及72 h時(shí)，抑制增殖作用均不明顯，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)藥物作用時(shí)間為24 h及72 h時(shí)，橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時(shí)對破骨細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)；當(dāng)藥物作用時(shí)間為48 h時(shí)，橄欖苦苷濃度為200 μg/mL時(shí)對破骨細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)；同一濃度中，隨著藥物作用時(shí)間的延長，橄欖苦苷對破骨細(xì)胞增殖的抑制作用也增強(qiáng)(P<0.05)(具體變化趨勢見圖2)。

圖2 不同濃度橄欖苦苷不同時(shí)間對破骨細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of oleuropein with different solubility and different time on the proliferation of osteoclasts

2.3 橄欖苦苷對破骨細(xì)胞膜完整性及活性的影響

與空白對照組比較，在加入400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL橄欖苦苷作用于破骨細(xì)胞48 h后，其釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的LDH酶活性分別為空白組149.35%、50 μg/mL 153.38%、100 μg/mL 155.84%、200 μg/mL 192.14%、400 μg/mL 254.27%(P<0.05)，表明橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的細(xì)胞膜有顯著的破壞作用(具體變化見圖3)。筆者考慮，橄欖苦苷可能通過破壞細(xì)胞的完整性，達(dá)到抑制破骨細(xì)胞增殖的效果，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖3 不同濃度橄欖苦苷對破骨細(xì)胞細(xì)胞膜完整性的影響(不同濃度橄欖苦苷組與空白組比較，P<0.05)Fig.3 Effect of oleuropein with different solubility on membrane integrity of osteoclasts (compared with the blank group, P<0.05)

3 討論

橄欖苦苷(oleuropein)是一種無毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物。新研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷能有效防治骨質(zhì)疏松癥，是藥食同源類中藥橄欖油的主要提取成分之一。卵巢癌患者術(shù)后因體內(nèi)雌激素水平急劇下降，對破骨細(xì)胞的產(chǎn)生、分化和激活的抑制作用減弱，導(dǎo)致破骨細(xì)胞大量增殖分化，其功能的活躍及凋亡的減少，使骨吸收速度超過骨形成速度。同時(shí)因雌激素的缺乏，其所介導(dǎo)的骨保護(hù)素表達(dá)減弱，骨量增加減少，抑制骨吸收及骨丟失的效用減弱[5]，造成骨質(zhì)有機(jī)物和無機(jī)物成比例地減少，使得骨質(zhì)疏松及骨折等并發(fā)癥的發(fā)病率顯著增高。此外，造成卵巢癌術(shù)后骨質(zhì)疏松的另一重要病因是炎癥因子[6]，如IL-1、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15的作用，同樣可引起骨吸收和重建的平衡失調(diào)。因卵巢癌是一種激素依賴型腫瘤，故術(shù)后的卵巢癌患者常規(guī)應(yīng)用植物雌激素或激素替代療法來防治骨質(zhì)疏松癥的安全性具有很大的爭議。研究表明，橄欖苦苷可以通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路[7-9]、降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6的分泌[3,10]、調(diào)控 MAPKP38-COX-2信號(hào)通路[11-13]3種途徑來防治婦科惡性腫瘤術(shù)后骨質(zhì)疏松。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，濃度為50 μg/mL的橄欖苦苷在破骨細(xì)胞增殖過程中無明顯抑制作用，而濃度為100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的橄欖苦苷對破骨細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制效果，且抑制效果與橄欖苦苷的濃度呈劑量依賴性，說明橄欖苦苷要在一定濃度下才能發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞增殖的效用，具體起始濃度、是否存在最大濃度，還有待進(jìn)一步探究。在橄欖苦苷保持同一濃度的前提下，抑制增殖的效用與作用時(shí)間呈正相關(guān)，說明用藥時(shí)間越長，防治骨質(zhì)疏松的效果越好，為臨床卵巢癌患者術(shù)后延緩骨質(zhì)疏松用藥時(shí)間提供一定依據(jù)。

LDH是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的酶。橄欖苦苷作用于破骨細(xì)胞48 h后，細(xì)胞膜的損傷導(dǎo)致細(xì)胞自身打開了缺口，儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)的LDH外流，使得細(xì)胞外的LDH活性顯著增強(qiáng)。因細(xì)胞膜完整性遭到破壞，使破骨細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。根據(jù)研究結(jié)果，細(xì)胞外LDH活性的增強(qiáng)與作用于破骨細(xì)胞的橄欖苦苷濃度呈劑量依賴性，說明細(xì)胞外LDH活性的增強(qiáng)和細(xì)胞凋亡率是由于橄欖苦苷對破骨細(xì)胞細(xì)胞膜的毒性作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，橄欖苦苷能夠抑制破骨細(xì)胞增殖，從而降低破骨細(xì)胞的骨吸收活性，起到延緩或防治骨質(zhì)疏松的效果。