祁珊珊 雒志恒 馮自立 龔帥 何佳 郝少陽 李婉

陜西理工大學維生素D生理與應用研究所，陜西 漢中 723000

婦女絕經后因卵巢功能下降、雌激素水平驟降，體內骨轉換率顯著加快，骨吸收的速度超過骨形成的速度，導致骨量丟失、骨密度下降、骨骼脆性增加引起的骨質疏松癥稱為絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。組織學和組織化學研究表明破骨細胞活動和骨吸收增加與骨髓肥大細胞增殖有關，研究發(fā)現(xiàn)老年性骨質疏松患者骨髓肥大細胞數(shù)量明顯增加[2-3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性肥大細胞增生癥也會導致骨質疏松[4-6]。然而上述研究僅限于對老年性骨質疏松癥患者骨髓肥大細胞的觀察，絕經后骨質疏松癥是否也伴隨骨髓肥大細胞的增生，骨髓肥大細胞增生是否可以成為骨質疏松診斷和治療的依據(jù)？本研究以去卵巢大鼠為絕經后骨質疏松疾病模型，觀察和計數(shù)肥大細胞在骨質疏松大鼠骨組織中的分布，探討肥大細胞作為絕經后骨質疏松癥診斷和治療依據(jù)的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性12 w齡未孕SD大鼠20只，體重(245±33)g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[SCXK(軍)2012-0007]。所有動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1 w后進行實驗。

1.2 試劑與儀器

大鼠雌二醇(estradiol，E2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand ，RANKL)測定試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。儀器主要有酶標儀(Biotek)、石蠟組織切片機(Leica RM2235)、倒置熒光顯微鏡(Nikon)、計算機圖像分析系統(tǒng)(Image pro plus 6.0)。

1.3 卵巢去除手術

將20只SD大鼠分為假手術組(Sham組)和去卵巢組(OVX組)，其中Sham組10只，OVX組10只。OVX組大鼠參考筆者先前報道的方法實施卵巢去除手術[7]。Sham組大鼠實施假手術，術后1 w對OVX組大鼠進行陰道涂片，連續(xù)涂片觀察5 d，去卵巢組不出現(xiàn)動情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 血液樣本采集和分析

去除卵巢后3個月，所有大鼠CO2麻醉后眼眶靜脈采血，離心收集血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清E2、ALP、OPG、RANKL含量，檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 骨組織樣本采集

采血結束后，取股骨近端干骺端、脛骨近端干骺端放入3.7%的多聚甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗后置于10%的EDTA緩沖溶液(pH 8.0)中進行脫鈣(脫鈣時間約為20 d左右)。

1.6 骨組織肥大細胞染色觀察

脫鈣結束后，對骨組織樣本進行固定、脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)，改良甲苯胺藍染色，95%的酒精分化，脫水，透明，封片，光學顯微鏡觀察骨組織肥大細胞的分布。

1.7 肥大細胞的計數(shù)

每個骨組織樣本每隔 5張連續(xù)切片計數(shù)一張，共計5張，低倍鏡下(10× 10)計數(shù)每張骨組織切片中所有肥大細胞，并求 5張切片肥大細胞的均數(shù)，據(jù)此求得各組肥大細胞計數(shù)值。

1.8 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素組間方差分析和比較，結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血清E2、ALP、OPG、RANKL檢測結果

大鼠血清 E2、ALP、OPG、RANKL檢測結果如表1所示，大鼠卵巢去除后3個月，血清E2、OPG含量較Sham組顯著降低(P<0.01)，ALP和RANKL的含量較Sham組顯著增加(P<0.01)，血清生化指標證實大鼠卵巢去除后3個月呈現(xiàn)骨質疏松癥狀。

表1 兩組大鼠血清骨代謝生化指標檢測結果Table 1 Results of serum biochemical markers of bone metabolism in rats of the two n=10)

2.2 骨肥大細胞的分布及形態(tài)

大鼠骨肥大細胞的分布基本一致，肥大細胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿內充滿紫紅色的異染性顆粒，并存在脫顆?，F(xiàn)象，散在分布于骨組織中，其在脛骨、股骨組織中的分布均集中于骨髓腔，在骨小梁中無肥大細胞分布(圖1)。

圖1 肥大細胞在大鼠骨組織中的分布。A：Sham組大鼠脛骨干骺端肥大細胞(甲苯胺藍 400×)；B：OVX組大鼠脛骨干骺端肥大細胞(甲苯胺藍 400×)；C：Sham組大鼠股骨干骺端肥大細胞(甲苯胺藍 400×)；D：OVX組大鼠股骨干骺端肥大細胞(甲苯胺藍 400×)；箭頭所示為肥大細胞Fig.1 Distribution of mast cells in bone tissue of rats. A: Mast cells in the tibial metaphysis of Sham rats (toluidine blue, 400×); B: Mast cells in the tibia metaphysis of OVX rats (toluidine blue, 400×); C: Mast cells in the femoral metaphysis of Sham rats (toluidine blue, 400×); D: Mast cells in the femoral metaphysis of OVX rats (toluidine blue, 400×). The mast cells are shown in the arrow.

2.3 去卵巢骨質疏松大鼠骨組織肥大細胞數(shù)量變化

大鼠卵巢摘除后，股骨、脛骨干骺端肥大細胞的數(shù)量較Sham組明顯增多，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。OVX組大鼠骨組織肥大細胞數(shù)量約為Sham組的5倍，上述變化表明，大鼠卵巢去除后隨著體內雌激素水平的降低，骨組織肥大細胞數(shù)量呈遞增趨勢。見表2。

表2 兩組大鼠脛骨干骺端、股骨干骺端橫斷面全層肥大細胞數(shù)量比較Table 2 Comparison of the number of mast cells in cross-sectional layer of the tibia metaphysis and femoral metaphyseal between two n=10)

3 討論

PMOP是一種與衰老相關的內分泌疾病，主要發(fā)生在絕經后婦女，由于絕經后雌激素缺乏導致骨量減少及骨組織結構變化，使骨脆性增加，骨折發(fā)生率增加，絕經后婦女發(fā)生骨質疏松的患病率約為男性的4倍[1]。組織化學研究表明破骨細胞活動和骨吸收增加與骨髓肥大細胞增殖有關，1968年Frame最早運用組織化學的方法觀察和計數(shù)了老年性骨質疏松患者骨髓肥大細胞，發(fā)現(xiàn)老年性骨質疏松患者骨髓肥大細胞增生[8]，這個發(fā)現(xiàn)在1981年被Fallon等人[9]證實，他們的研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞主要分布在松質骨而非皮質骨，且在松質骨骨髓腔中分布，這與本研究結果一致。雖然肥大細胞與老年性骨質疏松癥的關系提出較早，但肥大細胞與絕經后骨質疏松癥是否也有聯(lián)系，這方面無人研究。

本研究發(fā)現(xiàn)3月齡大鼠去除卵巢后3個月呈現(xiàn)明顯的骨質疏松癥狀，主要表現(xiàn)在血清雌二醇含量急劇降低，血清ALP、RANKL含量急劇增加，血清OPG含量降低，筆者先前的動物實驗在對骨組織形態(tài)學等方面的研究證實3月齡大鼠去除卵巢后3個月骨小梁面積百分比、骨小梁厚度等均顯著降低[10]。本研究通過對脛骨干骺端、股骨干骺端組織切片肥大細胞的染色和計數(shù)發(fā)現(xiàn)OVX大鼠脛骨干骺端、股骨干骺端肥大細胞數(shù)量較Sham組顯著增加，OVX組脛骨、股骨骨髓腔肥大細胞數(shù)量約為Sham組的5倍，且肥大細胞主要分布在骨髓腔中，肥大細胞的形態(tài)區(qū)別不大。筆者前期在對去卵巢骨質疏松大鼠子宮肥大細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢去除后子宮肥大細胞數(shù)量也較Sham組顯著增加，給藥雌激素治療28 d后OVX組大鼠子宮肥大細胞數(shù)量又明顯降低[11]。Narita等[12]的研究認為，雌激素可使肥大脫顆粒，甚至細胞崩解，高濃度雌激素使肥大脫顆粒，導致其數(shù)量減少。

很多研究表明肥大細胞與骨重塑之間有密切聯(lián)系，在鈣缺乏大鼠骨組織中肥大細胞數(shù)量顯著增加[13-14]。肥大細胞含有肝素和血管活性物質，肥大細胞內的顆粒含肝素或肝素前體，當遇到物理或化學刺激可促使肥大細胞脫顆粒，此時肝素被釋出，研究發(fā)現(xiàn)肝素與骨吸收息息相關，Goldhaber[15]的研究發(fā)現(xiàn)肝素可以促進骨吸收，給兔子注射肝素后其發(fā)生自發(fā)性骨折的概率顯著增加。Relea等[16]的研究認為鋅對骨的代謝和支持起很重要的作用，鋅可直接影響骨骼發(fā)育，促進骨形成，抑制骨吸收，其主要作用機制是鋅具有穩(wěn)定肥大細胞和抑制內源性肝素顆粒釋放的作用。

本實驗所發(fā)現(xiàn)的絕經后骨質疏松大鼠骨髓腔肥大細胞增生進一步證實肥大細胞在骨重塑中具有重要意義，對了解肥大細胞在絕經后骨質疏松癥中的功能具有一定意義，也為絕經后骨質疏松癥的診斷和治療提供了一個新靶標。