楊 洋， 吳 湜， 郭 燕， 葉信予， 朱德妹， 林東昉， 徐曉剛

血液分離利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌耐藥性及相關(guān)臨床特征分析

楊 洋， 吳 湜， 郭 燕， 葉信予， 朱德妹， 林東昉， 徐曉剛

目的 了解利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌血流感染的臨床及病原菌耐藥特點。方法 收集利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌血液分離株，并測定藥敏；PCR及測序檢測耐藥基因cfr及23S rRNA耐藥突變；臨床分離株用脈沖場凝膠電泳（PFGE）進行同源性分析；病例資料分析。結(jié)果 從3例患者血標本中分離到5株利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌；這些臨床分離株對苯唑西林、左氧氟沙星、慶大霉素等常用抗菌藥物耐藥，僅對糖肽類、利福平和甲氧芐啶-磺胺甲唑敏感；5株耐藥菌的23S rRNA均存在突變，4株攜帶cfr基因；PFGE顯示5株臨床株屬同一譜型；3例患者均有留置深靜脈導(dǎo)管，2例曾接受利奈唑胺治療。結(jié)論 利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌呈多重耐藥表型；頭狀葡萄球菌對利奈唑胺耐藥由23S rRNA突變及cfr基因?qū)е拢婚L療程使用利奈唑胺及留置深靜脈導(dǎo)管可能是此類耐藥菌感染的危險因素。

利奈唑胺； 耐藥； 血培養(yǎng)； 頭狀葡萄球菌

頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）屬凝固酶陰性葡萄球菌，既是人類皮膚正常菌群，又是一種條件致病菌，可引起皮膚軟組織感染、血流感染等感染性疾病。利奈唑胺是第一個批準用于臨床的唑烷酮類抗菌藥物，是目前治療甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）、萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）等臨床重要耐藥病原菌感染的主要藥物之一。隨著該藥的廣泛應(yīng)用，各類細菌對其耐藥的報道日益增多，獲得外源性耐藥基因cfr及23S rRNA基因突變是導(dǎo)致細菌耐藥的主要機制[1]。近年我國浙江、江蘇等省份已有多所醫(yī)院報道利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌所致血流感染[2-4]。我院也曾出現(xiàn)頭狀葡萄球菌引起的血流感染病例，本研究擬對此類耐藥菌的耐藥性、耐藥機制、同源性以及相關(guān)臨床資料進行分析，初步了解其耐藥性形成機制及傳播特點，為防治其感染提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 5株頭狀葡萄球菌臨床株于2012年分離自上海華山醫(yī)院3例血流感染患者，12-53、12-86分離自患者1非同次標本，12-400分離自患者2，12-498、12-535分離自患者3非同次標本。藥敏試驗質(zhì)控株金黃色葡萄球菌ATCC29213為本研究所保存菌株；含cfr基因的利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌對照株由浙江大學醫(yī)學院張嶸教授惠贈。

1.1.2 主要試劑及儀器 Mueller Hinton（MH）培養(yǎng)基 、哥倫比亞培養(yǎng)基（英國OXOID公司）；合成引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；E試驗條（法國生物梅里埃公司）；瓊脂糖（美國Bio-Rad公司）；核酸純化試劑盒QIAamp DNA mini kit（德國Qiagen公司）；限制性內(nèi)切酶SmaI、PCR試劑（TaKaRa公司）。TP-600型PCR儀（TaKaRa公司）；脈沖場電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 病例資料分析 對3例患者的病史進行分析，了解其基礎(chǔ)疾病、抗菌藥物使用、深靜脈導(dǎo)管留置、血培養(yǎng)細菌檢出等資料。

1.2.2 臨床株菌種確認 采用通用引物8F、1492R（序列見表1）擴增臨床株的16S rRNA基因[5]，測序后與GenBank序列進行比對，以確認菌種。

1.2.3 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法測定常用抗菌藥物對臨床分離株的最低抑菌濃度（MIC），利奈唑胺的MIC用E試驗方法進行確認，判斷標準參照CLSI M100-S22。

1.2.4 核酸純化 細菌基因組DNA采用QIAamp DNA mini kit，按試劑盒說明書進行提取、純化，作為PCR擴增模板。

1.2.5 耐藥相關(guān)基因檢測及分析 采用表1所列引物進行PCR擴增，檢測臨床株中的cfr基因，獲取23S rRNA基因全序列，陽性擴增產(chǎn)物進一步測序及比對分析。

1.2.6 脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析 頭狀葡萄球菌臨床分離株SmaI酶切后進行PFGE電泳，分析其同源性，具體方法見參考文獻[2]。

表1 基因測序PCR引物Table 1 Primers used for PCR in this study

2 結(jié)果

2.1 病例資料

患者1，女性，51歲，患者2與患者3均為男性，年齡分別為52歲和78歲。3例患者均因腦外傷或腦出血等行顱腦手術(shù)后入住ICU，均留置深靜脈導(dǎo)管；住院期間均并發(fā)肺部感染，反復(fù)發(fā)熱，痰培養(yǎng)分離到肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌等革蘭陰性桿菌，均接受了美羅培南、酶抑制劑復(fù)方制劑等廣譜抗菌藥物的治療?；颊?和患者3在應(yīng)用利奈唑胺治療約2周后血培養(yǎng)檢出利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌，更換萬古霉素、利福平等藥物治療后體溫下降?；颊?病程中未曾接受利奈唑胺治療，在分離到菌株后更換了深靜脈導(dǎo)管，未使用新抗菌藥物，24 h后體溫下降至正常。

2.2 臨床株菌種確認

5株頭狀葡萄球菌臨床株的16S rRNA基因序列與GenBank序列進行比對，與數(shù)據(jù)庫中登錄號為L37599.1的頭狀葡萄球菌16S rRNA序列一致，證實此5株臨床株均為頭狀葡萄球菌。

2.3 對常用抗菌藥物敏感性

5株臨床菌均為甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS），對利奈唑胺、頭孢唑林、苯唑西林、慶大霉素、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥，對萬古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利福平、甲氧芐啶-磺胺甲唑敏感。MIC測定結(jié)果見表2。

表2 常用抗菌藥物對5株頭狀葡萄球菌臨床株的最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations of selected antimicrobial agents against 5 clinical isolates of S. capitis

2.4 耐藥相關(guān)基因分析

4株臨床分離耐藥株cfr基因PCR檢測陽性，1株陰性（圖1）。通過23S rRNA全序列分析發(fā)現(xiàn)，5株臨床株均存在23S rRNA第V功能區(qū)G2576T突變；由于頭狀葡萄球菌有多個23S rRNA基因在染色體中有多個拷貝，部分位點的測序峰圖顯示為雙峰，提示該株細菌中只有部分23S rRNA基因拷貝的相應(yīng)位點發(fā)生突變（圖2）。在其他功能區(qū)還有多個突變位點，如C1377G、C1472T、C2104T等。

圖1 cfr基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis for PCR product of cfr gene

圖2 含G2576T突變的23S rRNA的部分序列測序峰圖Figure 2 Chromatogram of partial 23S rRNA sequences containing mutation G2576T

2.5 PFGE分析

5株臨床株的PFGE譜型完全一致，且與分離自杭州地區(qū)的cfr基因陽性頭狀葡萄球菌對照株也相同。見圖3。

3 討論

利奈唑胺是一種新型化學合成的抗菌藥物，對臨床上重要的敏感和耐藥革蘭陽性菌，如MRSA、MRCNS、VRE、耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）以及多重耐藥結(jié)核分枝桿菌均有良好抗菌活性，是目前治療上述臨床耐藥革蘭陽性菌感染的重要藥物。隨著利奈唑胺臨床應(yīng)用增加，耐藥株的出現(xiàn)不可避免。早在本世紀初，在臨床試驗過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺耐藥的腸球菌菌株，近年我國浙江、江蘇等地多所醫(yī)院出現(xiàn)利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌感染病例[2-4]。

目前， 細菌對利奈唑胺耐藥的較明確機制主要包括靶位突變（如：23S rRNA基因、核糖體L3或L4蛋白編碼基因突變）以及cfr基因編碼23S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生[1]。23S rRNA是細菌核糖體50S亞基的組成部分，其突變可導(dǎo)致50S亞基的藥物作用靶位改變形成耐藥，不同菌種的突變位點略有不同，在葡萄球菌屬中以G2447U、U2500A、U2504C及G2576U突變常見[6]。細菌另一個耐利奈唑胺機制與細菌獲得外源性氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因cfr（chloramphenicol- fl orfenicol resistance）有關(guān)， 該基因編碼一種rRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，最初在分離自德國牛身上的1 株松鼠葡萄球菌質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)， 其質(zhì)粒可能在葡萄球菌之間轉(zhuǎn)移[7]。該基因的存在可使核糖體大亞基23S rRNA的A2503 位發(fā)生甲基化，導(dǎo)致細菌對利奈唑胺和氯霉素耐藥。

本研究中3例患者血標本中分離到的5株頭狀葡萄球菌均發(fā)現(xiàn)23S rRNA基因突變，其中4株攜帶cfr基因。既有23S rRNA基因突變，又攜帶cfr的3株頭狀葡萄球菌臨床株利奈唑胺MIC≥256 mg/L。通過對這3株臨床株23S rRNA基因測序峰圖比較發(fā)現(xiàn)，12-498號株2576位呈現(xiàn)T堿基單一峰，提示其所有23S rRNA基因均發(fā)生突變，該菌株的利奈唑胺MIC為512 mg/L；而12-53號及12-86號株2576位呈現(xiàn)T/G堿基雙峰，提示這2株細菌僅有部分23S rRNA基因拷貝發(fā)生突變，它們的利奈唑胺MIC為256 mg/L，表明23S rRNA基因耐藥突變累積可使利奈唑胺MIC升高，與文獻報道相符[1]。此次分離的12-535號株2576位也呈現(xiàn)T堿基單一峰，即所有23S rRNA基因拷貝都發(fā)生了突變，但該臨床株的利奈唑胺MIC 僅為32 mg/L，與12-498號株不同之處是缺少cfr基因，此現(xiàn)象表明cfr基因在菌株利奈唑胺耐藥性形成中具有重要作用。此外，這些耐藥株在23S rRNA第V功能區(qū)外還有多個突變位點，如C1377G、C1472T、C2104T等，這些突變位點是否與耐藥相關(guān)有待證實。

本研究中，同一病房3例患者先后分離的5株P(guān)FGE譜型完全一致，提示存在此類耐藥菌株克隆散發(fā)。病史資料顯示，3例患者均有留置深靜脈導(dǎo)管，且接受多種抗菌藥物治療。2例患者使用利奈唑胺抗感染治療2周期間，出現(xiàn)頭狀葡萄球菌耐藥株。這些利奈唑胺耐藥株對多數(shù)藥物耐藥，僅對萬古霉素、利福平等少數(shù)抗菌藥物敏感。2例患者檢出耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌后，應(yīng)用萬古霉素治療后病情好轉(zhuǎn)，提示這些耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌為血流感染病原。另一例患者分離到頭狀葡萄球菌后接受除利奈唑胺外多種抗革蘭陰性菌藥物治療，病情無好轉(zhuǎn)，但更換深靜脈導(dǎo)管后體溫下降。按《血管內(nèi)導(dǎo)管相關(guān)感染的預(yù)防與治療指南（2007）》的診斷標準[8]，患者1及患者3可診斷頭狀葡萄球菌所致的導(dǎo)管相關(guān)感染，患者2亦符合導(dǎo)管相關(guān)感染臨床診斷標準。

總之，對有留置深靜脈導(dǎo)管的患者，尤其長期使用利奈唑胺者，應(yīng)加強此類耐藥菌的監(jiān)測。如考慮導(dǎo)管相關(guān)感染可能，應(yīng)分別通過外周靜脈及深靜脈留置導(dǎo)管采集血標本進行培養(yǎng)，如病情允許可拔除或更換導(dǎo)管，并取導(dǎo)管尖端及皮下段進行培養(yǎng)以盡早明確診斷。此外，鑒于同一病房分離的5株利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌的PFGE譜型相同，提示存在克隆傳播，故應(yīng)加強消毒、隔離，控制其傳播。

圖3 利奈唑胺耐藥菌株染色體DNA經(jīng)SmaI酶切后的PFGE電泳圖Figure 3 PFGE prof i les of SmaI-digested chromosomal DNA of linezolid-resistant strains

[1] TEWHEY R， GU B， KELESIDIS T， et al. Mechanisms of linezolid resistance among coagulase-negative staphylococci determined by whole-genome sequencing [J]. MBio， 2014， 5（3）：e00894-e00914.

[2] CAI JC， HU YY， ZHANG R， et al. Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci and Enterococcus faecium from China [J]. J Med Microbiol，2012， 61（Pt 11）：1568-1573.

[3] YANG XJ， CHEN Y， YANG Q， et al. Emergence of cfrharbouring coagulase-negative staphylococci among patients receiving linezolid therapy in two hospitals in China [J]. J Med Microbiol， 2013， 62（Pt6）： 845-850.

[4] HUANG Y， XU Y， LIU G， et al. Emergence of linezolid resistance in a clinical Staphylococcus capitis isolate from Jiangsu Province of China in 2012 [J]. J Thorac Dis， 2014， 6（5）： e48-e53.

[5] GEE JE， DE BK， LEVETT PN， et al. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid confirmatory identification of Brucella isolates[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（8）：3649-3654.

[6] LONG KS， VESTER B. Resistance to linezolid caused by modif i cations at its binding site on the ribosome [J]. Antimicrob Agents Chemother，2012， 56（2）： 603-612.

[7] SCHWARZ S， WERCKENTHIN C， KEHRENBERG C. Identification of a plasmid-borne chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2000， 44（9）：2530-2533.

[8] 中華醫(yī)學會重癥醫(yī)學分會. 血管內(nèi)導(dǎo)管相關(guān)感染的預(yù)防與治療指南（2007）[J]. 中華內(nèi)科雜志， 2008，47（8）： 691-699.

Resistance mechanism and clinical feature of linezolid-resistant Staphylococcus capitis isolated from blood samples

YANG Yang, WU Shi, GUO Yan, YE Xinyu, ZHU Demei, LIN Dongfang, XU Xiaogang. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To understand the resistance mechanism and clinical feature of linezolid- resistant S. capitis isolated from blood samples. Methods Antimicrobial susceptibility testing was carried out to determine the susceptibility of clinical strains. PCR and sequencing analysis were used to analyze cfr gene and 23S rRNA mutation, which were associated with linezolid resistance. Patterns of pulsed-f i eld gel electrophoresis (PFGE) were analyzed in combination with clinical data to understand the clinical feature of S. capitis strains. Results Five linezolid-resistant S. capitis strains were isolated from blood samples of 3 patients. These strains were resistant not only to linezolid, but also to most of the commonly used antimicrobial agents except glycopeptides, rifampin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. Mutation was identif i ed in 23S rRNA genes of all the f i ve strains and cfr gene was found in four of the f i ve strains. PFGE typing showed the same type, which supported the homology of the 5 strains. Three patients had deep vein indwelling catheter and two of them were treated with linezolid. Conclusions Linezolid-resistant S. capitis isolates showed the phenotype of resistance to multiple antimicrobial agents. Linezolid resistance may be mediated by cfr gene and 23S rRNA mutations in S. capitis. Long-term use of deep vein indwelling catheter and linezolid treatment may increase the risk of linezolid-resistant S. capitis infection.

linezolid; antibiotic resistance; blood culture; Staphylococcus capitis

R378.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0382-05

10.16718/j.1009-7708.2017.04.007

2017-01-07

2017-03-16

國家自然科學基金（81573470），復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院科研啟動基金（2014QD18）。

復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

楊洋（1988—） 男，碩士研究生，技師，主要從事抗菌藥物藥效學及細菌耐藥性研究。

林東昉，E-mail：lindongfang@fudan.edu.cn。