趙子惠，成偉偉，陳伯祥，楊 明

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

一株副豬嗜血桿菌的分離鑒定及其遺傳進化分析

趙子惠，成偉偉，陳伯祥，楊 明

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

為確認導(dǎo)致甘肅省平?jīng)鍪幸晦r(nóng)場豬群死亡的原因，采集病死豬不同組織樣品進行檢測，從病死豬的臟器組織中分離到1株革蘭陰性桿菌，并對其進行生化鑒定、16S rRNA鑒定及遺傳進化分析，同時進行分離菌的致病性試驗、耐藥性分析、V因子需要試驗、“衛(wèi)星現(xiàn)象”觀察。結(jié)果表明：分離菌生化特性均符合副豬嗜血桿菌；其16S rRNA基因序列與Genbank中副豬嗜血桿菌株的同源性均高達99%。因此，將該分離菌鑒定為副豬嗜血桿菌，將其命名為PL2016。動物試驗及耐藥性試驗表明，該分離菌具有較強的致病性和多重耐藥性。16S rRNA 遺傳進化分析表明，該分離菌與副豬嗜血桿菌其他菌株具有很高的同源性，其核酸序列相似性高達99%以上。遺傳進化分析表明，該分離菌的ompP2、sodA基因與副豬嗜血桿菌其他菌株具有很高的同源性，其核酸序列相似性高達95%以上。

副豬嗜血桿菌；分離；鑒定；藥敏試驗

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的一種革蘭陰性小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，從單個的球桿菌到長的、細長的致絲狀菌體，革蘭染色陰性，主要導(dǎo)致保育期仔豬發(fā)生多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎[1-3]。近年來，副豬嗜血桿菌引起的豬的疾病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，發(fā)病率及死亡率仍持續(xù)上升[4]。我國嚴格要求必須淘汰Hps感染動物，加之防治的高昂費用及其耐藥性問題[5-7]，該病已給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅了當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[8]。

2016年10月，甘肅省平?jīng)鍪心池i場的豬群臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺、耳尖發(fā)紫，站立困難甚至癱瘓；剖檢病變表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，并導(dǎo)致20多頭豬只死亡，損失慘重。本研究對采集的病料進行了病原分離鑒定，確定該疫情由Hps感染所引起?；诖耍瑢Ψ蛛x菌株進行了藥物敏感試驗及16S rRNA基因、毒力基因的克隆和系統(tǒng)進化分析，以期為Hps感染的診斷和防治提供參考。

1 材料和方法

1.1病料

采自平?jīng)鍪邪l(fā)病豬場病死豬的心、肝、脾、肺、腎等組織及關(guān)節(jié)液。

1.2培養(yǎng)基及試劑

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均為OMEGA公司產(chǎn)品；2×PCR Mix，購自廣州東盛生物科技有限公司；pMD19-T載體，為Takara公司產(chǎn)品；T4 DNA ligase，購自Thermo公司；DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker，均為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；生化試劑及其他試劑，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞由本室保存。

1.3組織抹片鏡檢

無菌取病豬心臟、肺臟、脾臟等組織抹片，經(jīng)革蘭染色后鏡檢。并依此制備培養(yǎng)基進行細菌的分離鑒定。

1.4細菌的分離培養(yǎng)

在無菌條件下，取各組織病料，分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板、血平板（含NAD）、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板及SS瓊脂平板，TSA平板，置37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑選典型菌落進一步純化，并取純化菌經(jīng)革蘭染色后觀察菌體形態(tài)及染色特征。

1.5V因子需要試驗

將分離的細菌分別接種于TSA 平板和添加了NAD 的TSA 平板，于5%的CO2環(huán)境37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，檢查其生長特性及對V因子的需要性。

1.6“衛(wèi)星現(xiàn)象”觀察

取2個TSA 平板，分別接種所分離的細菌。在其中1個平皿的中心線位置，劃線接種金黃色葡萄球菌，于5% CO2環(huán)境37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h。觀察其是否在金黃色葡萄球菌周圍長出“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

1.7生化試驗

從TSA平板上挑取分離菌的單個菌落，接種于含NAD的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、苯丙氨酸、賴氨酸，三糖鐵，靛基質(zhì)，M.R，V-P，枸櫞酸鹽，H2S、觸酶及尿素酶等培養(yǎng)基中，按常規(guī)方法進行生化鑒定，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，并按Krieg等[9]所述的鑒定標準進行結(jié)果判定。

1.8藥敏試驗

參照刁菁等[10]所述方法進行藥敏試驗，步驟如下：將分離純培養(yǎng)物無菌劃線于TSA平板，靜置5 min后，用無菌鑷子取藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，置于5% CO237 ℃培養(yǎng)24 h后，測量各種藥敏紙片的抑菌圈直徑并判定結(jié)果。

1.9分離菌16S rRNA基因序列擴增及進化分析

參照Oliveira 等[12]的文獻，根據(jù)Hps 16S rRNA（M75065）的基因序列設(shè)計引物，PCR擴增產(chǎn)物片段約為821 bp左右。引物由金唯智生物有限公司合成：Hps 16SF：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′；Hps 16S R：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。反應(yīng)體系為30 μL：上、下游引物各0.5 μL，分離菌基因組DNA 2 μL，2×PCR Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃45 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收并與pMD19-T載體在16 ℃溫度條件下過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，應(yīng)用藍、白斑篩選并經(jīng)PCR的進一步驗證，陽性克隆送金唯智公司測序。將測序正確的分離菌株16S rRNA 核苷酸序列與GenBank 上其它Hps參考株16S rRNA 序列，用DNAStar 軟件包中的MegAlign 軟件進行核苷酸序列比對，分析核苷酸的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系，初步確定其血清型[13]。

1.10動物試驗

動物試驗分1個攻毒組和1個對照組，每組隨機分取5只BALB/c小鼠。攻毒組每只腹腔注射0.3 mL過夜培養(yǎng)的分離菌菌液，對照組每只注射0.3 mL生理鹽水，觀察并記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，小鼠死亡后剖檢觀察病理變化，并取肺臟組織涂片染色鏡檢。

1.11細菌毒力基因擴增及進化樹構(gòu)建

參照GenBank Hps的兩種毒力基因（sodA、ompP2）序列，設(shè)計并合成引物（表1）。分別擴增分離菌的相關(guān)毒力基因。反應(yīng)體系為30 μL：上、下游引物各0.5 μL、基因組DNA 2 μL、2×PCR Mix 15 μL、ddH2O 12 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收，連接至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，陽性克隆送金維智公司測序。

表1毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1細菌的分離培養(yǎng)

該菌涂片，經(jīng)革蘭染色，鏡檢，為革蘭陰性小桿菌（圖1）。該菌在含NAD的TSA平板上培養(yǎng)24～48 h，生長良好，形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤的菌落，在巧克力培養(yǎng)基上長成較細小、半透明露珠樣菌落；在普通瓊脂和營養(yǎng)肉湯上培養(yǎng)24～48 h后，未見細菌生長；在含NAD 的血平板上培養(yǎng)24～48 h，可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長，未見溶血現(xiàn)象。在普通瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基中均未見生長。

圖1細菌革蘭染色（1 000×）

2.2V 因子需要試驗

副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求較嚴格，生長需要血液中的生長因子，人工培養(yǎng)時必須供給V因子才能生長。在未添加NAD 的TSA平板上于5% CO237 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h 未見細菌生長，而在添加NAD的TSA平板上生長良好，說明其生長需要V因子。

2.3“衛(wèi)星現(xiàn)象”觀察

在金黃色葡萄球菌兩側(cè)可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌愈近菌落生長越好，愈遠菌落越小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”（圖2）；而在未接種金黃色葡萄球菌的另外一個平板則不見細菌生長。

圖2衛(wèi)星現(xiàn)象

2.4生化試驗

試驗結(jié)果與Hps生化特征一致（表2），因此初步判定該菌為Hps。

2.516S rRNA鑒定

16SrRNA基因擴增結(jié)果顯示，其PCR擴增產(chǎn)物約為821 bp（圖3）。測序結(jié)果表明，該菌16S rRNA基因序列與Hps 16S rRNA基因序列的同源性為99%，因此確定分離菌為Hps。

表2細菌生化試驗結(jié)果

圖3 16S rRNA基因PCR擴增

2.6動物試驗

動物接種試驗結(jié)果表明，接種分離菌的試驗組小白鼠均在接種4 h出現(xiàn)精神沉郁、被毛逆立、站立不穩(wěn)、呼吸急促等臨床癥狀，24 h內(nèi)5只小白鼠全部死亡；肺臟點狀出血，肝臟腫大，并再次從病死小白鼠肺臟分離到相同細菌，而對照組小鼠均未見任何異常變化，表明該細菌對小白鼠具有較強的致病性。

2.7藥敏試驗

在所選擇的18種常用抗生素中，分離菌對鏈霉素、妥布霉素、左氟沙星、苯唑西林、哌拉西林、頭孢哌酮氯霉素、紅霉素、卡那霉素高度敏感，對慶大霉素、諾氟沙星、多粘菌素B等中度敏感，而對磺胺甲唑、氨曲南等其余幾種抗生素耐受（表3）。

表3藥敏試驗結(jié)果

2.8Hps分離株16S rRNA基因的遺傳進化分析

將PL2016分離株16S rRNA基因核苷酸序列與GenBank中公布的其它Hps參考株序列，利用DNAStar軟件進行遺傳進化分析。由圖4可知，Hps分離株及其它Hps參考株位于進化樹的兩個不同分支上，屬于兩個不同的亞群。其中，分離株P(guān)L2016 株16S rRNA與3株血清5型Hps參考株AB078972、AB078973、AB078974的16S rRNA序列位于一個分支上，屬于一個亞群，它們之間的核苷酸同源性在99.0%～99.4%之間。

圖416S rRNA基因系統(tǒng)進化樹

2.9毒力基因及進化樹構(gòu)建

兩種毒力基因sodA、ompP2均被成功擴增（圖5）。

2.9.1sodA基因的遺傳進化分析。對分離菌sodA基因的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并將其序列與其他Hps菌株的sodA基因序列進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示分離菌株與其他所有菌株同源性相對較高（圖6）。

2.9.2ompP2基因的遺傳進化分析。對分離菌ompP2基因PCR擴增產(chǎn)物測序及遺傳進化分析結(jié)果表明，分離菌與其他Hps株分屬兩個不同的亞群（圖7），但分離菌與其他菌株的ompP2基因同源性較近。

圖5毒力基因PCR擴增

圖6 sodA基因系統(tǒng)進化樹

圖7ompP2基因系統(tǒng)進化樹

3 討論

Hps在健康豬群的呼吸道中常在，在飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、機體免疫力低下等特定條件下，Hps可導(dǎo)致豬群發(fā)病，多發(fā)于秋冬季節(jié)[14]。近年來，國內(nèi)外由Hps引起疾病的報道較多。該菌的臨床分離株多數(shù)具有多重耐藥和強致病性，從而導(dǎo)致臨床治療困難加大。本研究對引起平?jīng)鍪心池i場豬只發(fā)病死亡的病原菌進行了分離鑒定，從肺臟中分離到1株革蘭陰性的多態(tài)性的細菌。通過對其進行生化試驗鑒定、16S rRNA鑒定及序列分析、V因子需要試驗、“衛(wèi)星現(xiàn)象”觀察，最終確定分離菌為Hps。

基于16S rRNA序列分析的細菌鑒定，為細菌的快速鑒定和其所致疾病的快速診斷提供了新的手段。本試驗從分離菌基因組擴增出約821 bp的16S rRNA基因，對分離菌的16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明該菌與副豬嗜血桿菌的同源性達到了99%，進一步確證了分離菌為Hps。由此可見，應(yīng)用傳統(tǒng)的生化試驗鑒定細菌法，并結(jié)合16S rRNA鑒定方法，所得結(jié)果更為確切。

動物感染試驗中，接種了分離菌菌懸液的試驗組小白鼠均在24 h內(nèi)死亡，且死亡小鼠各臟器病變明顯，表明分離菌致病性強，但其毒力的確定有待進一步完成。此外，藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌耐藥譜廣泛，獸醫(yī)臨床常用的多種抗菌藥物對其均無明顯的作用，這就是臨床病例的治療過程中應(yīng)用多種抗菌藥物均未有效控制疫情的主要原因，這也可能與該豬場在飼養(yǎng)過程中抗菌藥物的使用不當(dāng)有關(guān)。

本研究分離株P(guān)L2016株16S rRNA與其它Hps參考株16S rRNA的遺傳進化關(guān)系，表明分離株P(guān)L2016株16S rRNA與3株血清5型Hps 參考株AB078972、AB078973、AB078974的16S rRNA序列位于一個分支上，屬于一個亞群，它們之間的核苷酸同源性在99.0%～99.5%之間。

在兩個毒力基因中，ompP2編碼外膜蛋白，sodA編碼的金屬鎂依賴的超氧化物歧化酶蛋白是一種防御蛋白，可以使細胞抵御氧化應(yīng)激，及時修復(fù)受損細胞。對于一些具有侵襲性的細菌病原來說，超氧化物歧化酶在致病過程中非常重要，兩種毒力基因的遺傳進化分析結(jié)果顯示分離菌株與其他Hps菌株具有很高同源性，且非常保守，說明這兩個基因在Hps生長繁殖和致病過程中有著非常重要的作用。

本研究采集臨床病料，通過細菌的分離鑒定及藥物敏感試驗，為分離菌株所致疾病的臨床治療提供了參考。通過16S rRNA基因的擴增及其遺傳進化分析，為Hps分子流行病學(xué)的分析提供了依據(jù)，也為研究該菌的致病機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Isolation，Identif i cation and Genetic Evolution Analysis on a Strain of Swine Haemophilus parasuis

Zhao Zihui，Cheng Weiwei，Chen Boxiang，Yang Ming
（Gansu Institute of Animal and Veterinary Science，Pingliang，Gansu 744000）

In order to confirm the pathogenic bacteria which caused the death of swine that came from a farm of Pingliang city of Gansu province，the different tissues samples from dead swine were collected and one gram-negative，rod-shaped bacterium was isolated from viscera tissue of dead swine. Biochemical identification，16S rRNA gene sequence analysis，pathogenicity test，drug resistance analysis，V factor test and satellite phenomenon observation were carried out. The results demonstrated that all biochemical characteristics of the isolate were consistent with Haemophilus parasuis，and the 16S rRNA sequence of the isolate shared 99% homology with most Haemophilus parasuis from Genbank. Therefore，the isolate was finally identified as Haemophilus parasuis，and it was named as PL2016. Animal test and drug sensitivity test indicated that the Haemophilus parasuis strain PL2016 has stronger pathogenicity and multiple drug resistance. The genetic evolution analysis showed that the homology of 16S rRNA gene from the strain PL2016 and the other strains of Haemophilus parasuis were higher，it′s similarity of nucleotide sequence was over 99%. The genetic evolution analysis showed that the ompP2 and sodA genes from the strain PL2016 and the other strains of Haemophilus parasuis were higher homology at nucleotide level with over 95% identities.

Haemophilus parasuis；isolation；identif i cation；drug sensitivity test

S851.3

A

1005-944X（2017）08-0092-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.024

甘肅省省級科技計劃項目（GNSW-2007-14）