樊曉旭，哈登楚日亞，2，王英麗，王 姣，劉春菊，遲田英，趙永剛，張志誠，吳曉東，王志亮

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國家外來病研究中心，山東青島 266032；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3. 常州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇常州 213002）

塞尼卡谷病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的建立

樊曉旭1，哈登楚日亞1，2，王英麗1，王 姣3，劉春菊1，遲田英1，趙永剛1，張志誠1，吳曉東1，王志亮1

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國家外來病研究中心，山東青島 266032；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3. 常州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇常州 213002）

塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）可感染豬，引起類似口蹄疫病毒感染造成的水皰性病變，新生仔豬病死率達(dá)30%～70%。本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA），針對(duì)SVV 3D基因設(shè)計(jì)了引物和探針，并進(jìn)行篩選、反應(yīng)條件優(yōu)化以及敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，建立了實(shí)時(shí)熒光RPA方法。結(jié)果顯示，本方法在40 ℃、10 min內(nèi)檢測(cè)的最低濃度為28拷貝/μL；與口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應(yīng)；通過3次重復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)2.8×106～2.8×101拷貝/μL的6個(gè)稀釋度樣品，在熒光強(qiáng)度達(dá)1 500 mV所需時(shí)間變異系數(shù)范圍在2.44%～14.95%。該等溫、快速擴(kuò)增方法為豬群出現(xiàn)水皰性疾病的鑒別診斷提供了技術(shù)支持，對(duì)及時(shí)采取適當(dāng)防控措施具有重要意義。

塞尼卡谷病毒；實(shí)時(shí)；熒光；重組酶聚合酶擴(kuò)增

塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），又稱為Senecavirus A（SVA），是豬原發(fā)性皰疹病（Swine idiopathic vesicular disease，SIVD）的主要病原。SVV感染豬群后，盡管不會(huì)造成與口蹄疫病毒相同的較大政治、經(jīng)濟(jì)損失，但所引起的水皰性病變，與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難[1]。目前，北美、南美地區(qū)以及澳大利亞都有豬群發(fā)生SIVD的報(bào)道[2]。我國于2016年也首次分離到了SVV[3]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)了RT-PCR、熒光定量PCR、ELISA等SVV實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但上述方法操作繁瑣，需依賴昂貴的儀器，且耗時(shí)較長（2 h以上）[4-5]。本研究采用的重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplif i cation，RPA）是近年來出現(xiàn)的恒溫、核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，已廣泛用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲診斷研究[6]。在擴(kuò)增反應(yīng)中，重組酶首先與上下游引物結(jié)合，尋找、定位同源的雙鏈DNA，進(jìn)行鏈交換；聚合酶從上下游引物的3′端啟動(dòng)模板合成，形成兩條雙鏈DNA。該方法在37～42 ℃，10～30 min，對(duì)核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增，最低可檢測(cè)1～1 000個(gè)拷貝的DNA或RNA分子。RPA結(jié)果讀取方式多樣，可采用瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光、側(cè)流層析試紙條的方式，如已成功建立了犬細(xì)小病毒2型RPA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法、中東呼吸綜合征冠狀病毒RPA實(shí)時(shí)熒光方法、賈第鞭毛蟲RPA側(cè)流層析試紙條檢測(cè)方法[7-9]。目前國際上尚無采用實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)SVV的報(bào)道。本研究建立了實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，為SVV快速診斷及防控提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1毒株及核酸

口蹄疫病毒O型緬甸98株（FMDV）cDNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） CH-1R株cDNA、豬瘟病毒C株（CSFV）cDNA、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）CV777株和豬傳染性胃腸炎病毒華毒株（TGEV）cDNA，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)時(shí)熒光RPA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

根據(jù)NCBI中登錄的SVV全基因序列（NC_011349.1），合成基因共7.31 kb。全基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選擇BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，將目的基因克隆于pUC19載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-SVV，載體為pUC19，重組質(zhì)粒濃度為300 ng/μL，約為2.8×1010拷貝數(shù)，作為實(shí)時(shí)熒光RPA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)熒光RPA監(jiān)測(cè)儀器TwistaTM，購自TwistDX公司；2×Probe qPCR Mix試劑盒，購自Takara公司；Twist Amp exo試劑盒，購自TwistDX公司。

1.4引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中登錄的SVV 3D基因序列（NC_011349.1），分別使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3組引物和探針，分別為：組合1（P-1），包括F1、R1、Pb1；組合2（P-2），包括F2、R2a、Pb2；組合3（P-3），包括F2、R2b、Pb2（表1）。將探針和引物進(jìn)一步通過NCBI的BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析，比較設(shè)計(jì)的探針和引物序列與主要豬病病毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）的序列匹配度，確定引物和探針的特異性，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化

在pUC19-SVV質(zhì)粒模板濃度為10-3ng的條件下，按照Twist Amp exo試劑盒說明書，在50 μL反應(yīng)體系中，在預(yù)添加exo酶的PCR反應(yīng)管中加入Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH2O 8.2 μL，10 μmol/L上游引物（F）2.1 μL，10 μmol/L下游引物（R）2.1 μL，10 μmol/L探針（P）0.6 μL，DNA模板5 μL，Mg2+2.5 μL；將PCR管放入實(shí)時(shí)熒光RPA監(jiān)測(cè)儀器TwistaTM，設(shè)定反應(yīng)溫度和時(shí)間；在溫度為35、37、39、40、42 ℃下反應(yīng)15 min，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6熒光定量PCR反應(yīng)

采用Probe qPCR Mix試劑盒，使用前期研究報(bào)道的引物探針[5]，在20 μL的反應(yīng)體系中，2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物0.8 μL，探針0.4 μL，cDNA模板2 μL，加水補(bǔ)齊至20 μL，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；94 ℃15 s、60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。將pUC19-SVV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋（2.8×106～2.8×100拷貝/μL）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，測(cè)定CT值。

1.7特異性試驗(yàn)

應(yīng)用1.5中所篩選的最優(yōu)反應(yīng)體系，以FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA作為模板，利用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.8敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用1.5中所篩選的最優(yōu)反應(yīng)體系，并參照方法1.6，將pUC19-SVV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋至7個(gè)濃度（2.8×106～2.8×100拷貝/μL），分別作為模板，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的最小檢出量。測(cè)定熒光強(qiáng)度超過1 500 mV時(shí)所需的時(shí)間，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，比較兩種檢測(cè)方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用1.5中所篩選的最優(yōu)反應(yīng)體系，對(duì)2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103、2.8×102、2.8×101、2.8×100拷貝/μL，共7個(gè)稀釋梯度的pUC19-SVV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做3批重復(fù)檢測(cè)，并以ddH2O作為陰性對(duì)照，確定檢測(cè)方法的重復(fù)效果。

1.10統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1引物和探針

2 結(jié)果

2.1引物篩選

本研究設(shè)計(jì)了3組引物探針組合，通過NCBI的BLAST，并與主要豬病病毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）序列比對(duì)分析，確定其特異性良好。在39 ℃下，使用組合1、2、3，對(duì)2.8×102拷貝/μL樣品進(jìn)行RPA擴(kuò)增。結(jié)果顯示，組合1、3樣品相比陰性對(duì)照，隨時(shí)間推移熒光強(qiáng)度逐漸升高（圖1-A），其中組合3熒光強(qiáng)度可達(dá)3 000 mV以上，高于組合1和2，差異極顯著（P＜0.0001）（圖1-B）。此外，組合3達(dá)到1 500 mV所需時(shí)間顯著小于組合1，而組合2熒光強(qiáng)度未達(dá)到1 500 mV（圖1-C）。因此，選擇組合3引物探針用于后續(xù)方法的研究。

圖1 SSV RPA引物探針組合篩選

2.2實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件優(yōu)化

為了篩選反應(yīng)最佳溫度和最適時(shí)間，特選取35、37、39、40、42 ℃下，最長反應(yīng)15 min，檢測(cè)濃度為2.8×103拷貝/μL樣品的RPA擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度越高，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移熒光強(qiáng)度上升越快，溫度為40 ℃和42 ℃時(shí)，在6 min內(nèi)熒光強(qiáng)度即超過1 000 mV。而在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，40 ℃的重復(fù)性好于42 ℃（圖2）。因此本研究選擇40 ℃為本方法的工作溫度。

圖2不同溫度條件下RPA反應(yīng)

在40 ℃的條件下，利用組合3引物探針，將拷貝數(shù)為2.8×106～2.8×100拷貝/μL的7個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品和ddH2O，作為陰性對(duì)照擴(kuò)增20 min，結(jié)果顯示，擴(kuò)增10 min時(shí)，濃度為28個(gè)拷貝/μL樣品的測(cè)定結(jié)果為陽性。當(dāng)擴(kuò)增20 min時(shí)，2.8 拷貝/μL樣品熒光強(qiáng)度值緩慢提升到1 000 mV。陰性對(duì)照從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束一直未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為擴(kuò)增設(shè)定時(shí)間，檢出限為28個(gè)拷貝/μL（圖3）。

圖3不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RPA反應(yīng)時(shí)間

2.3特異性試驗(yàn)

為了確定RPA方法的特異性，選取濃度為2.8×105、2.8×101拷貝/μL SVV陽性標(biāo)準(zhǔn)品以及FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA進(jìn)行反應(yīng)，cDNA濃度均為10 ng/μL，用量為5 μL。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，反應(yīng)10 min后，SVV陽性標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度明顯升高，相比之下，其他病毒陽性cDNA測(cè)得的熒光強(qiáng)度無明顯升高變化，說明本方法可以特異性擴(kuò)增SVV核酸，可用于SVV的檢測(cè)（圖4）。

圖4 SVV實(shí)時(shí)熒光RPA的特異性試驗(yàn)

2.4敏感性試驗(yàn)

為了確定實(shí)時(shí)熒光RPA方法的最小檢出量，本研究分別選取不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)時(shí)熒光RPA監(jiān)測(cè)儀要求的熒光強(qiáng)度1 500 mV作為陽性檢出限，并與熒光定量PCR方法進(jìn)行敏感度比較。結(jié)果顯示，RPA方法可在4 min內(nèi)檢測(cè)到濃度為2.8×106拷貝/μL的樣品，對(duì)應(yīng)的熒光定量PCRCt值為16.06±0.03，在10 min內(nèi)，可檢測(cè)最低濃度為2.8×101拷貝/μL的樣品，對(duì)應(yīng)的熒光定量PCRCt值為34.41±0.46（圖5），說明實(shí)時(shí)熒光RPA敏感度與熒光定量PCR方法相當(dāng)，但檢測(cè)所需要的時(shí)間從熒光定量PCR的2 h縮短至10 min。

圖5 SVV實(shí)時(shí)熒光RPA的敏感性試驗(yàn)

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)本檢測(cè)方法的重復(fù)性，采用了6個(gè)不同稀釋梯度的pUC19-SVV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，反應(yīng)10 min，各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度值組間變異系數(shù)范圍在0.39%～39.78%，熒光強(qiáng)度達(dá)1 500 mV所需時(shí)間變異系數(shù)范圍在2.44%～14.95%。樣品濃度越高，檢測(cè)所需時(shí)間越短，2.8×106拷貝/μL樣品在4 min內(nèi)，熒光強(qiáng)度值即可達(dá)到1 500 mV。

表2SVV實(shí)時(shí)熒光RPA的重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

通常認(rèn)為，豬水皰性疾?。╒esicular disease，VD）由口蹄疫病毒（FMDV，小RNA病毒科口瘡病毒屬）、水皰性口炎病毒（VSV，彈狀病毒科水皰病毒屬）、豬傳染性水泡病毒（VESV，杯狀病毒科水皰疹病毒屬）、豬水皰?。⊿VD，小RNA病毒科腸病毒屬）4種病毒引起。但近年來，美國、巴西、澳大利亞等國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了豬“水皰性”臨床癥狀，而經(jīng)檢測(cè)，上述4種病毒均為陰性。隨后，該病被確定為豬原發(fā)性皰疹?。⊿wine idiopathic vesicular disease，SIVD）[2]。SVV本身并不會(huì)給生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。但由于動(dòng)物感染該病毒后，口部、鼻腔部以及蹄冠帶等部位出現(xiàn)皰疹，需要進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒別診斷，以排除動(dòng)物感染FMD的可能。目前，針對(duì)SVV感染的診斷方法包括病毒中和試驗(yàn)、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法、PCR方法[10-11]。此外，本實(shí)驗(yàn)室成功建立了快速、敏感的TaqMan熒光定量PCR診斷方法，僅需2 h，即可通過核酸的特異性擴(kuò)增，完成鑒別診斷[5]。

在RPA診斷方法研究中，Wang等[9]采用瓊脂糖凝膠電泳方式，檢測(cè)RPA擴(kuò)增的犬細(xì)小病毒2型，在10 min可最低檢測(cè)到10拷貝DNA分子；Abd El Wahed 等[7]采用實(shí)時(shí)熒光的方式，檢測(cè)中東呼吸綜合征冠狀病毒，在10 min可最低檢測(cè)到10拷貝RNA分子；Teoh等[12]建立的登革熱實(shí)時(shí)熒光RPA方法耗時(shí)20 min，檢出限為10個(gè)拷貝的RNA分子；Rohrman等[13]建立的側(cè)流層析試紙條RPA方法檢測(cè)HIV，在10 min可最低檢測(cè)到1 000個(gè)拷貝數(shù)的DNA分子；Crannell等[8]開發(fā)的側(cè)流層析試紙條RPA方法檢測(cè)賈第鞭毛蟲，在30 min可最低檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的DNA分子。本研究開發(fā)的SVV實(shí)時(shí)熒光RPA方法，在10 min內(nèi)可檢測(cè)28個(gè)拷貝數(shù)的DNA分子，敏感度與上述研究結(jié)果類似，在反應(yīng)時(shí)間上，將熒光定量PCR耗時(shí)2 h縮短至10 min，在保證檢測(cè)敏感度的同時(shí)提高了檢測(cè)效率。

RPA方法開發(fā)近10年，除了其等溫、快速擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)外，引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高給本方法的實(shí)際應(yīng)用造成一定的困難。在引物設(shè)計(jì)方面，由于單鏈綁定蛋白需要寡核苷酸長度在30～35 bp以上才能將引物整合到雙鏈DNA[14]，因此RPA的上下游引物長于普通PCR及qPCR引物；此外，RPA探針長度約為46～52 個(gè)核苷酸，也長于qPCR的探針，加之目前無軟件輔助，RPA引物探針設(shè)計(jì)難度高于普通PCR及qPCR。盡管如此，RPA商業(yè)開發(fā)公司，TwistDX公司在引物設(shè)計(jì)方面給出了相關(guān)建議：擴(kuò)增產(chǎn)物長度在500 bp以內(nèi)，以100～200 bp 為宜；5′端3～5個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免出現(xiàn)多個(gè)G；在3′端應(yīng)有GC；避免連續(xù)出現(xiàn)多個(gè)相同核苷酸；GC 含量占30%～70%；避免引物形成二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，按照上述建議設(shè)計(jì)了3組探針引物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2組可用于實(shí)驗(yàn)，其中組合3（148 bp）的擴(kuò)增效果好于組合1（210 bp），也印證了“片段長度100～200 bp 為宜”的要求。在生產(chǎn)成本方面，以本研究應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光RPA為例，單個(gè)樣品的檢測(cè)成本約50元人民幣，高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（約20元/樣）。但是，實(shí)時(shí)熒光RPA監(jiān)控儀價(jià)格為45 000元左右，遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（30萬～50萬），且該儀器體積小，便于攜帶，反應(yīng)耗時(shí)短，更適于POC（床旁）及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。例如，2014年幾內(nèi)亞暴發(fā)埃博拉疫情時(shí)，RPA技術(shù)被成功應(yīng)用到移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)埃博拉病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷中[15]。綜上，本研究設(shè)計(jì)并成功篩選出一組引物探針，建立了實(shí)時(shí)熒光RPA方法，用于SVV核酸的檢測(cè)。結(jié)果顯示，反應(yīng)在40 ℃ 10 min內(nèi)，可最低檢測(cè)到陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為28 拷貝/μL，且不與FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV等發(fā)生交叉反應(yīng)。本方法特異、敏感、重復(fù)性良好，且使用方便、耗時(shí)短，可在豬群出現(xiàn)水皰性臨床癥狀的早期做出快速診斷，便于及時(shí)采取有效措施，控制疫病的傳播擴(kuò)散。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplif i cation（RPA）for the Detection of Seneca Valley Virus

Fan Xiaoxu1，Hadengchuriya1，2，Wang Yingli1，Wang Jiao3，Liu Chunju1，Chi Tianying1，Zhao Yonggang1，Zhang Zhicheng1，Wu Xiaodong1，Wang Zhiliang1
（1. National Research Center for Exotic Animal Disease，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；3. Changzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Changzhou，Jiangsu 213002）

Seneca valley virus（SVV）can affected swine，which can cause vesicular lesions similar to the infection of foot and mouth disease virus，with the neonatal mortality rate of 30%～70%. A real-time RPA method was established in this study，based on recombinase polymerase amplification technology （RPA）. Assemblies of primers and probes targeting SVV 3D gene were developed and screened，while reaction conditions were optimized before sensitivity，specif i city and repeatability of the test were determined. The results showed that the lowest concentration of 28 copies/μL could be detected within 10 min at 40 ℃. No cross reaction was found between SVV and the foot and mouth disease virus，classical swine fever virus，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus. In the 3 repeated tests of six series diluted samples（2.8×106～2.8×101copies/μL），the coeff i cient of variation of time when the fl uorescence intensity reached 1 500 mV was in the range of2.44%～14.95%. The isothermal and rapid amplif i cation method provides technical support for the differential diagnosis of vesicular disease among swine，and it is of great signif i cance to take appropriate preventive measures in a timely manner.

Seneca valley virus；real-time；f l uorescence；recombinase polymerase amplif i cation

S852.65

A

1005-944X（2017）08-0081-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.022

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0501104）

并列第一作者：樊曉旭、哈登楚日亞

王志亮