曾靜 郭建軍 袁林 楊罡 陳俊

（江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330096）

極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性的優(yōu)化研究

曾靜 郭建軍 袁林 楊罡 陳俊

（江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330096）

旨在獲得高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的α-淀粉酶。通過向α-淀粉酶ApkA中引入目前已知的最穩(wěn)定的α-淀粉酶PFA的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，獲得Zn2+結(jié)合位點(diǎn)突變體ApkAdsK152H/A166C。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，ApkAdsK152H/A166C的高溫活性和熱穩(wěn)定性明顯提高，最適反應(yīng)溫度由90℃提高至100℃，對應(yīng)的酶比活力為5 201.08 U/mg。ApkAdsK152H/A166C于90℃的半衰期由5 h延長至10 h，于100℃的半衰期由7.5 min延長至80 min。重組α-淀粉酶中Zn2+含量測定結(jié)果顯示ApkAdsK152H/A166C結(jié)合了一個(gè)Zn2+。結(jié)果表明，向ApkA中引入Zn2+結(jié)合位點(diǎn)有利于提高其高溫活性和熱穩(wěn)定性。

極端嗜熱α-淀粉酶；Zn2+-結(jié)合位點(diǎn)；定點(diǎn)突變；高溫活性；熱穩(wěn)定性

α-淀粉酶能切斷淀粉的1，4-α-D-葡萄糖苷鍵，生成短鏈糊精和少量低分子量糖類，從而降低淀粉糊的粘度，液化淀粉，因此α-淀粉酶又稱液化酶［1-4］。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于燃料酒精、淀粉糖漿、傳統(tǒng)釀造、食品加工、紡織退漿、飼料等行業(yè)，是迄今最早的工業(yè)應(yīng)用酶之一［5-7］，占據(jù)全球酶制劑生產(chǎn)量約30%的份額［8］。

目前淀粉加工工業(yè)常用的α-淀粉酶主要是來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的BLA，其最適作用條件為90℃和pH6.0［5］，在高于100℃和pH低于6.0的條件下易失活，熱穩(wěn)定性依賴于Ca2+，液化過程中需要加入Ca2+作為保護(hù)劑，在液化和糖化過程中需要反復(fù)調(diào)節(jié)pH［9］。從而導(dǎo)致淀粉液化不徹底，生產(chǎn)成本高，工序復(fù)雜，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。針對目前常用α-淀粉酶所存在的問題，國內(nèi)外對α-淀粉酶的研究和開發(fā)的主要目標(biāo)是獲得最適反應(yīng)溫度在100℃或以上，最適pH在4.0-5.0，不需要添加Ca2+來維持其高溫活性和熱穩(wěn)定性的高溫酸性α-淀粉酶［10］。

源于極端嗜熱微生物的極端嗜熱酸性α-淀粉酶具有反應(yīng)溫度高、液化速度快、對Ca2+依賴性小、酶的熱穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，在耐熱性、最適pH和Ca2+依賴性3個(gè)方面的性能均優(yōu)于BLA，具有較大的應(yīng)用潛力和開發(fā)前景［11，12］。源于極端嗜熱古生菌（Thermococcus kodakarensis）KOD1的胞外α-淀粉酶ApkA屬于極端嗜熱酸性α-淀粉酶，其最適反應(yīng)溫度為90℃，反應(yīng)pH為5-6.5，在未補(bǔ)加Ca2+的條件下于90℃保溫1 h 后保持90%的剩余活性［13］。ApkA具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，并且耐酸性強(qiáng)，綜合性質(zhì)優(yōu)于其他α-淀粉酶，在淀粉液化工藝中具有較大的應(yīng)用潛力。為了滿足淀粉液化工藝的要求，需要進(jìn)一步提高ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性。本研究擬向ApkA中引入目前已知的最穩(wěn)定的極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，對ApkA進(jìn)行改造和優(yōu)化，為ApkA的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL、大腸桿菌表達(dá)載體pET28a、重組質(zhì)粒pET28a-ApkAds均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基采用含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 KOD-Plus-neo DNA聚合酶購自日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker購自美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 購自美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow購 自 美 國 GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)［14-15］進(jìn)行。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-ApkAdsK152H/A166C的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)QuikChange?點(diǎn)突變試劑盒的原理，結(jié)合α-淀粉酶ApkA基因ApkA和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物K152H-F、K152H-R。以pET28a-ApkAds為模板，采用引物K152H-F和K152H-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 20 s，68℃ 4 min，35個(gè) 循 環(huán)；68℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測序鑒定是否為突變基因ApkAdsK152H。在此基礎(chǔ)上，以pET28a-ApkAdsK152H為模板，采用引物A166C-F和A166C-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，獲得重組質(zhì)粒pET28a-ApkAdsK152H/A166C。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物

1.2.3 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL。從新鮮的轉(zhuǎn)化平板上挑取重組大腸桿菌單菌落，接種于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1%接種量轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液A600nm達(dá)到0.5左右。加入IPTG至其終濃度為0.25 mmol/L，繼續(xù)于16℃培養(yǎng)20 h，12 000 r/min離心5min收集菌體沉淀。

采 用50 mmol/L 2-（N-嗎 啡 啉 ） 乙 磺 酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid，MES），pH6.5緩沖液重懸并洗滌菌體沉淀，再加入適量50 mmol/L MES，pH6.5緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤海捎肧DS-PAGE檢測重組α-淀粉酶的表達(dá)情況。

采用Ni2＋親和層析柱對細(xì)胞可溶成分中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，利用SDS-PAGE檢測重組α-淀粉酶的純度，并采用Bradford法測定重組α-淀粉酶的濃度。

1.2.4 α-淀粉酶的酶活力測定 將10 μL酶液與490 μL 含1%（m/V）可溶性淀粉的50 mmol/L MES，pH 6.5緩沖液混合，于90℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法［16］測定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.5 α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì) 將酶液與不同pH值的1%可溶性淀粉溶液混合，于90℃條件下進(jìn)行酶活測定。采用不同緩沖液配制不同pH 值的1%可溶性淀粉溶液：50 mmol/L MES（pH4.0-7.0）、50 mmol/L 3-（N-瑪琳代）丙磺酸緩沖液（3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）（pH 7.0-8.5）。

按照上述反應(yīng)體系混合酶液和底物，分別于40-120℃反應(yīng)30 min，測定不同溫度條件下酶比活力，并以酶比活力對溫度作圖，確定其最適反應(yīng)溫度。其中，40-95℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于水浴中進(jìn)行，100-120℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于甘油浴中進(jìn)行。高溫條件下測定α-淀粉酶活性時(shí)，反應(yīng)樣品置于O型環(huán)螺旋蓋密封管內(nèi)，以防止水分蒸發(fā)。

用50 mmol/L MES（pH 6.5）緩沖液配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性淀粉溶液（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%和5%），分別向可溶性淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.2.4節(jié)方法測定酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計(jì)算以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km、反應(yīng)常數(shù)kcat。

將酶液于90℃或100℃保溫，分時(shí)間梯度取出部分樣品，按照1.2.4節(jié)方法測定酶活。將未處理的酶液的酶活定義為100%，并以相對酶活的百分比對時(shí)間作圖，評價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 α-淀粉酶中Zn2+含量的測定 向濃度約為1 mg/mL的重組α-淀粉酶中補(bǔ)加EDTA至其終濃度為2 mmol/L，分別將樣品于20℃和90℃保溫1 h，然后采用透析法除去樣品中EDTA。分別取1 mL未經(jīng)處理的重組α-淀粉酶和處理后的重組α-淀粉酶，采用電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）［17］測定樣品中Zn2+濃度，并以最后一次透析液作為對照樣品。1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 11.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果

2.1 定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

采用BLASTP比對ApkA與來源于不同極端嗜熱古生菌的α-淀粉酶的氨基酸序列，結(jié)果（圖1）顯示ApkA與PFA、TH_amy1、TO_amy1分別具有89%、86%和86%的氨基酸序列相似性。PFA中參與結(jié)合Zn2+的氨基酸殘基包括His147、His152和Cys166。在ApkA中，與這些氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸殘基分別是His147、Lys152和Ala166。鑒于該Zn2+結(jié)合位點(diǎn)對于PFA熱穩(wěn)定性的重要性，本研究設(shè)計(jì)ApkA中氨基酸殘基K152和A166為突變位點(diǎn)，向ApkA中引入PFA中Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建雙位點(diǎn)突變體ApkAdsK152H/A166C。

2.2 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET28a-ApkAds和 pET28a-ApkAdsK152H/A166C分別轉(zhuǎn) 化 大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，獲得重組大腸桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。如圖2所示，目的蛋白質(zhì)ApkAds和ApkAdsK152H/A166C均得到成功表達(dá)，其表觀分子質(zhì)量均約為45 kD，大小與理論值相符。

圖1 ApkA與其他α-淀粉酶的氨基酸序列比對結(jié)果

圖2 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測圖

2.3 ApkAds和ApkAdsK152H/A166C的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.3.1 pH對重組α-淀粉酶的酶活的影響 以1%可溶性淀粉為底物，于不同pH值條件下測定重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsK152H/A166C的相對酶活，結(jié)果如圖3所示。與ApkAds相比，突變體ApkAdsK152H/A166C的最適反應(yīng)pH值以及pH 4.0-8.5之間的相對酶活均未明顯改變。

圖3 pH值對酶活的影響

2.3.2 溫度對重組α-淀粉酶的酶活的影響 以1%可溶性淀粉為底物，于不同溫度條件下測定重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsK152H/A166C的酶比活力，結(jié)果如圖4所示。ApkAds的最適反應(yīng)溫度為90℃，在此溫度條件下的酶比活力為2 946.75 U/mg；突變體ApkAdsK152H/A166C的最適反應(yīng)溫度為100℃，在此溫度條件下的酶比活力為5 201.08 U/mg，并且突變體于120℃仍能保持54.47%的相對酶活，在40-120℃間其酶比活力均明顯高于野生型ApkAds的酶比活力。

圖4 溫度對酶活的影響

2.3.3 重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 重組α-淀粉酶以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km和反應(yīng)常數(shù)Kcat如表2所示，與野生型ApkAds相比，90℃突變體ApkAdsK152H/A166C的Km未明顯改變，Kcat值提高約1.90 倍。即突變體ApkAdsK152H/A166C的底物結(jié)合能力未明顯改變，以可溶性淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率明顯提高。

表2 90℃重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.4 重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性 如圖5所示，在90℃和100℃的條件下，突變體ApkAdsK152H/ A166C的熱穩(wěn)定性均高于野生型ApkAds的熱穩(wěn)定性。其中ApkAds于90℃的半衰期約為5 h，ApkAdsK152H/A166C于90℃的半衰期約為10 h；ApkAds于100℃ 的 半 衰 期 約 為7.5 min，ApkAdsK152H/A166C于100℃的半衰期約為80 min，提高了10.67倍。

圖5 90℃（A）和100℃（B）重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性

2.3.5 重組α-淀粉酶中Zn2+含量 采用電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）測定重組α-淀粉酶未經(jīng)EDTA處理以及經(jīng)EDTA處理后的樣品中Zn2+含量，結(jié)果如表3所示。未經(jīng)EDTA處理，突變體ApkAdsK152H/A166C中Zn2+含量明顯高于ApkAds中Zn2+含量。ApkAds于20℃或90℃經(jīng)EDTA處理后，EDTA幾乎完全螯合了ApkAds所結(jié)合的Zn2+。針對突變體ApkAdsK152H/A166C，于90℃下EDTA才能螯合其所結(jié)合的Zn2+。根據(jù)所測得的數(shù)值，推斷ApkAdsK152H/A166C結(jié)合了一個(gè)Zn2+。

3 討論

大多數(shù)α-淀粉酶屬于糖苷水解酶類的第13家族，具有第13家族酶分子結(jié)構(gòu)上的共同特征：（1）酶分子的三級結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成；（2）酶分子的一級結(jié)構(gòu)含有4個(gè)保守區(qū)域，這4個(gè)保守區(qū)域包含酶分子的催化活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)；（3）酶分子具有相同或相近的催化機(jī)理［1］。此外，α-淀粉酶的高溫適應(yīng)性機(jī)制符合蛋白質(zhì)高溫適應(yīng)性機(jī)制的一般規(guī)律，包括降低熱不穩(wěn)定的氨基酸殘基（如天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸等）的含量、增強(qiáng)非共價(jià)作用力、減少溶劑可及的疏水表面、提高二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、提高酶分子結(jié)構(gòu)的緊湊性、結(jié)合金屬離子、形成多聚體、翻譯后修飾等因素［18］。Linden等［19］通過對比極端嗜熱α-淀粉酶PFA與其他低溫、中溫微生物來源的α-淀粉酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PFA分子結(jié)構(gòu)的緊湊性、離子鍵、Ca2＋-Zn2＋雙金屬離子結(jié)合位點(diǎn)對于其維持熱穩(wěn)定性非常重要。Machius等［20］和Qin等［21］關(guān)于目前工業(yè)上廣泛應(yīng)用的α-淀粉酶BLA的熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域B之間的Ca2+-Zn2+-Ca2+三金屬離子結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對于BLA維持熱穩(wěn)定性非常重要。

表3 重組α-淀粉酶中Zn2+含量

綜合以上兩點(diǎn)，大多數(shù)α-淀粉酶具有共同的結(jié)構(gòu)特征和相似的高溫適應(yīng)性機(jī)制，這有利于參照具有優(yōu)良高溫活性和熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)特征對其它α-淀粉酶進(jìn)行分子改造，從而提高其高溫活性和熱穩(wěn)定性。例如，Machius等［22］通過向BLA分子表面引入疏水性氨基酸殘基，獲得了85℃熱穩(wěn)定性提高了約40倍的突變體H133V/N190F/A209V/ N264S/Q265Y。這些氨基酸位點(diǎn)的突變主要是通過提高酶分子結(jié)構(gòu)的緊湊性、增強(qiáng)金屬離子的結(jié)合、穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)疏水相互作用來提高BLA的熱穩(wěn)定性。Ghollasi等［23］通過改造來源于Bacillus megaterium WHO的α-淀粉酶的Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)，獲得了最適反應(yīng)溫度提高5℃的突變體H77E?？聺龋?4］向高溫酸性α-淀粉酶BD5088中引入二硫鍵，獲得了100℃酶活力和酶活力半衰期均提高約1倍的突變體BD5088C2。曾靜等［25］向極端嗜熱α-淀粉酶ApkA中引入離子鍵K180-D212，獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的突變體ApkAdsA180K。

PFA是目前已知的熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的α-淀粉酶，其最適反應(yīng)溫度高達(dá)100℃，于98℃的半衰期長達(dá)13 h［26］。Savchenko等［17］通過比較PFA和其Zn2+結(jié)合位點(diǎn)突變體的高溫活性和熱穩(wěn)定性，證實(shí)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)有利于PFA維持其熱穩(wěn)定性。此外，Linden等［19］通過對比PFA與其他低溫微生物、中溫微生物來源的α-淀粉酶的分子結(jié)構(gòu)也發(fā)現(xiàn)，PFA中Zn2+結(jié)合位點(diǎn)對于其維持熱穩(wěn)定性非常重要。本研究通過向ApkA中引入PFA中與其熱穩(wěn)定性相關(guān)的Zn2+-結(jié)合位點(diǎn)，獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到有效提高的突變體ApkAdsK152H/A166C。本研究結(jié)果表明該Zn2+-結(jié)合位點(diǎn)有利于提高ApkA的反應(yīng)速率和熱穩(wěn)定性。前期研究已通過分子改造獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性提高的離子鍵突變體ApkAdsA180K［26］、酸性條件下酶活和穩(wěn)定性以及高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的N-糖基化突變體ApkAdsD182N/G373S［27］。后續(xù)工作將已驗(yàn)證的有利突變進(jìn)行組合，以獲得更適于淀粉液化工藝的耐熱酸性α-淀粉酶。

4 結(jié)論

本研究獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的突變體ApkAdsK152H/A166C，其最適反應(yīng)溫度由90℃提高至100℃，90℃的酶比活力提高約1.55倍，100℃的酶比活力提高約2.43倍，于90℃的半衰期提高約2倍，于100℃的半衰期提高約10.6倍。重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析顯示，ApkAdsK152H/A166C結(jié)合可溶性淀粉的能力未發(fā)生明顯變化，其降解可溶性淀粉的反應(yīng)速率提高約1.90倍。此外，重組α-淀粉酶中Zn2+含量測定結(jié)果表明ApkAdsK152H/A166C結(jié)合了一個(gè)Zn2+。

［1］Jane?ek ?, Svensson B, Macgregor EA. α-Amylase：an enzyme specificity found in various families of glycoside hydrolases［J］. Cellular and Molecular Life Sciences, 2014, 71（7）：1149-1170.

［2］Rana N, Walia A, Gaur A. α-Amylases from microbial sources and its potential applications in various industries［J］. National Academy Science Letters, 2013, 36（1）：9-17.

［3］Zhang Q, Han Y, Xiao H. Microbial α-amylase：a biomolecularoverview［J］. Process Biochemistry, 2017, 53：88-101.

［4］Homaei A, Ghanbarzadeh M, Monsef F. Biochemical features and kinetic properties of α-amylases from marine organisms［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 83：306-314.

［5］Souza PM. Application of microbial α-amylase in industry-a review［J］. Brazilian Journal of Microbiology, 2010, 41（4）：850-861.

［6］Kumari A, Singh KM, Kayastha A. α-Amylase：general properties, mechanism and biotechnological applications-a review［J］. Current Biotechnology, 2012, 1（1）：98-107.

［7］Atomi H, Sato T, Kanai T. Application of hyperthermophiles and their enzymes［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22（5）：618-626.

［8］Prakash O, Jaiswal N. α-Amylase：an ideal representative of thermostable enzymes［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 160（8）：2401-2414.

［9］Konsoula Z, Liakopoulou-Kyriakides M. Co-production of α-amylase and β-galactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates［J］. Bioresource Technology, 2007, 98（1）：150-157.

［10］Zhou W, You C, Ma H, et al. One-pot biosynthesis of highconcentration α-glucose 1-phosphate from starch by sequential addition of three hyperthermophilic enzymes［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64（8）：1777-1783.

［11］Dalmaso GZL, Ferreira D, Vermelho AB. Marine extremophiles：a source of hydrolases for biotechnological applications［J］. Marine Drugs, 2015, 13（4）：1925-1965.

［12］曾靜, 郭建軍, 邱小忠, 等. 極端嗜熱微生物及其高溫適應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2015（9）：30-37.

［13］Tachibana Y, Leclere MM, et al. Cloning and expression of the α-amylase gene from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp. KOD1, and characterization of the enzyme［J］. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1996, 82（3）：224-232.

［14］Green MR, Sambrook J. Molecular cloning：a laboratory manual［M］. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.

［15］Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature, 1970, 227：680-685.

［16］Bernfeld P. Amylases, α and β［J］. Methods in Enzymology, 1955, 1：149-158.

［17］ Savchenko A, Vieille C, Kang S, et al. Pyrococcus furiosus α-amylase is stabilized by calcium and zinc［J］. Biochemistry, 2002, 41（19）：6193-6201.

［18］Dey TB, Kumar A, Banerjee R, et al. Improvement of microbial α-amylase stability：strategic approaches［J］. Process Biochemistry, 2016, 51（10）：1380-1390.

［19］Linden A, Mayans O, Meyer-Klaucke W, et al. Differential regulation of a hyperthermophilic α-amylase with a novel（Ca, Zn）two-metal center by zinc［J］. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278（11）：9875-9884.

［20］Machius M, Declerck N, Huber R, et al. Activation of Bacillus licheniformis α-amylase through a disorder→ order transition of the substrate-binding site mediated by a calcium-sodium-calcium metal triad［J］. Structure, 1998, 6（3）：281-292.

［21］Qin Y N, Fang Z, Pan FG, et al. Significance of Tyr302, His235 and Asp194 in the α-amylase from Bacillus licheniformis［J］. Biotechnology Letters, 2012, 34（5）：895-899.

［22］Machius M, Declerck N, Huber R, et al. Kinetic stabilization of Bacillus licheniformis α-amylase through introduction of hydrophobic residues at the surface［J］. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278（13）：11546-11553.

［23］Ghollasi M, Ghanbari-Safari M, Khajeh K. Improvement of thermal stability of a mutagenised α-amylase by manipulation of the calcium-binding site［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53（6）：406-413.

［24］柯濤, 劉征, 楊建偉, 等. A154C/G155C雙點(diǎn)突變對嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩(wěn)定性的影響［J］. 食品科學(xué), 2012, 33（3）：207-211.

［25］曾靜, 郭建軍, 等. 定點(diǎn)突變提高極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性［J］. 食品科學(xué), 2017, 38（2）：20-26.

［26］J?rgensen S, Vorgias Ce, Antranikian G. Cloning, sequencing, characterization, and expression of an extracellular α-amylase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli and Bacillus subtilis［J］. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（26）：16335-16342.

［27］曾靜, 郭建軍, 袁林. N-糖基化修飾對極端嗜熱酸性α-淀粉酶ApkA酶學(xué)性質(zhì)的影響［J］. 食品科學(xué), 2017, 38（6）：1-6.

（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of the Thermal Activity and Stability of Hyperthermophilic α-amylase ApkA

ZENG Jing GUO Jian-jun YUAN Lin YANG Gang CHEN Jun
（Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330096）

This work aims to obtain α-amylase with improved thermal activity and stability. Based on the structure analysis of hyperthermophilic α-amylase ApkA and the most thermo-stable α-amylase PFA，a Zn2+-binding site mutant ApkAdsK152H/A166C was constructed by introducing the Zn2+-binding site of PFA into ApkA. The mutant ApkAdsK152H/A166C exhibited effective increase in terms of thermal activity and stability. The optimal temperature of the mutant increased from 90℃ to 100℃ and the corresponding specific activity was 5 201.08 U/mg. The half-life of ApkAdsK152H/A166C prolonged from 5 h to 10 h while incubated at 90℃，and from 7.5 min to 80 min at 100℃. The results of Zn2+content measurement in recombinant α-amylases confirmed that ApkAdsK152H/A166C bound with one Zn2+ion. These results suggested that the introduction of Zn2+-binding site improved the thermal activity and stability of ApkA.

hyperthermophilic α-amylase；Zn2+-binding site；site-directed mutagenesis；thermo-activity；thermostability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0172

2017-03-09

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31501422），江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20171BAB214003），江西省科學(xué)院資助項(xiàng)目（2014-YYB-08，2014-XTPH1-08）

曾靜，女，博士，助理研究員，研究方向：極端嗜熱酶的開發(fā)與應(yīng)用；E-mail：zengjingwhu@126.com

袁林，男，博士，副研究員，研究方向：工業(yè)微生物的應(yīng)用；E-mail：yuanlincn2003@aliyun.com