文山野生牛肝菌多糖的提取測(cè)定及抗氧化性研究

周云波，徐懷春，劉 芳，陳紅惠

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

文山野生牛肝菌多糖的提取測(cè)定及抗氧化性研究

周云波，徐懷春，劉 芳，陳紅惠

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

測(cè)定文山兩種野牛肝菌的蘑菇多糖，并研究其抗氧化性能。以文山野生的黑牛肝菌和白牛肝菌為研究材料，采用水煮醇沉的方法提取了蘑菇多糖，用苯酚—硫酸法測(cè)定了含量，用Vc作對(duì)比，研究?jī)煞N牛肝菌多糖對(duì)羥基自由基的清除能力,評(píng)價(jià)牛肝菌多糖的抗氧化活性。研究表明，文山野生的黑牛肝菌、白牛肝菌的多糖含量約為17.3%、29.6%，提取率為0.44%、0.98%；且兩種牛肝菌多糖對(duì)羥基自由基都具有一定的清除能力，且與濃度呈線性關(guān)系，當(dāng)黑牛肝菌多糖和白牛肝菌多糖的濃度均為10.338 μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除能力都達(dá)到最強(qiáng)，清除率分別為43.4%和57.7%，略低于Vc的清除率，兩種牛肝菌多糖均能清除羥基自由基，都具有抗氧化活性。

野生牛肝菌；牛肝菌多糖；水煮醇沉；苯酚—硫酸法；抗氧化活性

牛肝菌[Xerocomus badius（Fr·）Kiihner exGilb]是菌物界中大型擔(dān)子菌的重要類型，屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina），擔(dān)子菌綱（Basid-iomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Bole-taceae），下分11～20屬，多數(shù)可以食用。[1-2]中國(guó)牛肝菌科種類有397種和變種，其中有毒牛肝菌33種，占總數(shù)8.3%。大部分無(wú)毒無(wú)苦辣味的種類都可食用。[3-4]云南省牛肝菌類資源豐富，有不少優(yōu)良的可食品種，主要有白、黃、黑牛肝菌。白牛肝菌，又稱美味牛肝菌，牛肝菌富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、氨基酸和各種礦質(zhì)元素，其中多糖是一類含有多種活性物質(zhì)的大分子化合物，是由醛糖和酮糖以糖苷鍵連在一起的多聚物，可分為同型多糖和異型多糖兩大類。[5-7]蘑菇多糖是提高人體免疫力的首選營(yíng)養(yǎng)品，有較強(qiáng)的抗癌活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)致癌物質(zhì)有吸收。[8]研究表明：活性多糖作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，主要作用于機(jī)體的免疫系統(tǒng)，具有增強(qiáng)免疫活性、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗突變、抗輻射、降血脂、降血糖和降血壓等多種功能[9-10]，是一種很好的天然有機(jī)化合物。

牛肝菌的研究集中在多糖的提取和抗氧化活性的方面。李志洲等[11]對(duì)美味牛肝菌的子實(shí)體中多糖提取的最佳工藝條件進(jìn)行了研究，采用溶劑提取的方法確定了美味牛肝菌中多糖提取的最佳提取工藝條件為加水20倍，溫度為80 ℃，pH=8時(shí)浸提1 h，多糖得率可達(dá)7.37%；王一心等[12]研究了黑牛肝菌、華美牛肝菌中的降血脂能力和抗氧化能力，其研究結(jié)果表明兩種菌都能增加體內(nèi)清除自由基的能力，在體內(nèi)有明顯的抗氧化作用。西歐各國(guó)有廣泛食用白牛肝菌的習(xí)慣，云南省從1973年起出口白牛肝菌，銷往西歐，極受歡迎，供不應(yīng)求。牛肝菌已成為我國(guó)出口創(chuàng)匯的重要菌類產(chǎn)品，僅云南省2002年就出口5 600 t牛肝菌制品，創(chuàng)匯1 700萬(wàn)美元。云南省文山州牛肝菌多糖的提取尚未有人研究，為了更好的開(kāi)發(fā)利用這一野生植物資源，文章主要以云南省文山州野生的黑牛肝菌和白牛肝菌兩種菌種為實(shí)驗(yàn)材料,采用水煮醇沉法[13]，提取兩種牛肝菌多糖，用苯酚—硫酸法[14]，以葡萄糖標(biāo)品為參照測(cè)定其含量；以Vc作對(duì)比，利用清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)Smirnoff的方法[15]來(lái)測(cè)定兩種牛肝菌多糖的抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)藥食兩用的真菌資源提供重要的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生的黑牛肝菌和白牛肝菌，購(gòu)于文山市。

1.2 主要儀器

分析天平（瑞士普利賽斯XT系列）；DHG9076電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津制作所）；離心機(jī)；電熱恒溫水浴鍋；電熱套。

1.3 主要試劑

20%三氯乙酸；95%乙醇；無(wú)水乙醇；乙醚；5%苯酚；濃硫酸；0.1 mol/L FeSO4溶液；0.1 mol/L水楊酸-乙醇溶液；30 %H2O2溶液;蒸餾水；Vc（抗壞血酸）；葡萄糖標(biāo)品（GR）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的預(yù)處理

樣品剪碎，烘箱70 ℃烘至恒重，萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，粉末儲(chǔ)存于干燥箱中，備用。

2.2 牛肝菌多糖的提取

水煮醇沉法來(lái)提取牛肝菌多糖。準(zhǔn)確稱取黑牛肝菌粉末5.0 g，按液料比1∶20加蒸餾水于燒杯中，于水浴鍋提取3次，每次1 h，用紗布過(guò)濾得到清液，殘?jiān)鼇G棄。將3次水提取濾液合并，然后在70 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行濃縮。向濃縮液中加入等體積的三氯乙酸（脫蛋白）搖勻，靜置過(guò)夜，然后離心，取上清液。將上清液加入3倍體積95%的乙醇后，靜置醇沉過(guò)夜。對(duì)醇沉后的溶液進(jìn)行離心，棄上清液，取沉淀，沉淀依次通過(guò)無(wú)水乙醇，乙醚進(jìn)行洗滌，再離心，取離心管中的沉淀，置于濾紙上，于干燥箱中烘干，即可得到黑牛肝菌多糖。同理，采用相同的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)提取白牛肝菌多糖，備用。

2.3 牛肝菌多糖的含量測(cè)定

采用苯酚—硫酸法[14]來(lái)測(cè)定多糖的含量。反應(yīng)原理：在高溫下，多糖與濃硫酸迅速反應(yīng)生成單糖，單糖在強(qiáng)酸作用下，能與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物，而且在波長(zhǎng)為490 nm處有最大吸收峰。苯酚硫酸試劑可與游離的單糖、寡糖或多糖中的己糖、戊糖、糖醛酸等起顯色反應(yīng)，己糖在波長(zhǎng)為490 nm處（戊糖及糖醛酸在480 nm處）有最大吸收峰，且在一定范圍內(nèi)，吸光值與糖含量呈現(xiàn)線性關(guān)系。

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)干燥的葡萄糖1.0000 g于容量瓶中，定容到100 mL，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10.0 mg/ mL。分別移取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于5個(gè)50 ml容量瓶中且定容至刻度，搖勻，此時(shí)5種溶液濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL。分別移取2.00 mL的5種溶液于干燥試管中，每支試管加入5%苯酚溶液0.50 mL，搖勻。然后分別加入2.50 mL的濃硫酸，充分搖勻后，在室溫下靜置15 min，然后在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)得其相應(yīng)的吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖濃度與吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸線方程和線性范圍。

2.3.2 多糖含量的測(cè)定

分別稱取干燥的黑牛肝菌多糖和白牛肝菌多糖50.0 mg（提取樣品重量）于50 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻。從兩個(gè)樣品中分別移取2.00 mL于相應(yīng)的干燥試管中，每支試管加入5%苯酚溶液0.50 mL，搖勻。然后分別加入2.50 mL的濃硫酸，充分搖勻后，在室溫下靜置15 min，然后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)得其相應(yīng)的吸光度值，根據(jù)回歸線方程來(lái)計(jì)算出樣品中的多糖含量。多糖得率（%）＝純化多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

2.4 牛肝菌多糖抗氧化性的測(cè)定

利用清除羥基自由基試驗(yàn)Smirnoff的方法來(lái)測(cè)定兩種牛肝菌多糖的抗氧化活性。試驗(yàn)原理：利用H2O2與亞鐵離子混合后，產(chǎn)生·OH，在體系里加入水楊酸以捕捉·OH并產(chǎn)生有色，該有色物質(zhì)在波長(zhǎng)為510 nm處有最大吸收。

在測(cè)定多糖含量時(shí)，根據(jù)苯酚—硫酸法，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得50.00 mL黑牛肝菌多糖的吸光度值為0.620 A，根據(jù)回歸線方程，可得到其濃度為0.1723 mg/mL。分別移取該濃度溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于5個(gè)50 mL的容量瓶中，均用蒸餾水定容到刻度，搖勻。經(jīng)計(jì)算，5種溶液濃度分別為3.446 μg/mL、6.892 μg/mL、10.338 μg/mL、13.784 μg/mL、17.230 μg/mL。取6支干燥的試管，每支試管均加入1.00 mL 0.1 mol/L的FeSO4溶液，2.00 mL 0.1 mol/L的水楊酸-乙醇溶液，然后從這6支試管中取出5支試管，分別加入2.00 mL的5種不同濃度的溶液，另外一支試管加入2.00 mL的蒸餾水，作為空白對(duì)照，最后每支試管均加入2.00 mL的30%的H2O2溶液，然后在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min。以對(duì)照組作空白調(diào)零，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定各種濃度樣品的吸光度值。按相同的方法，對(duì)每個(gè)濃度樣品的吸光度值再進(jìn)行測(cè)定兩次，最后取3次吸光度值的平均值。

用電子天平分別精確稱取0.0090 g（m＝50.0 mL ×0.1723 mg/mL＝8.615 mg≈0.0090 g）的Vc和白牛肝菌多糖于兩個(gè)干燥的50 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻，則可得兩種溶液的濃度均（約）為0.1723 mg/mL。以相同的條件和方法，分別對(duì)Vc和白牛肝菌多糖的吸光度值進(jìn)行3次測(cè)定，最后均取平均值。

羥基自由基清除率的計(jì)算公式：

·OH清除率（%）＝（A0-Ax）/A0×100%式中：A0——空白對(duì)照液的吸光度值A(chǔ)x——加入多糖液（或Vc液）的吸光度

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

3.1 兩種牛肝菌多糖的提取

表1 兩種牛肝菌多糖的提取質(zhì)量/g

由表1可知，兩種牛肝菌在相同的操作條件下，白牛肝菌所提取得到的粗多糖質(zhì)量和純化后多糖質(zhì)量均大于黑牛肝菌的，且多糖質(zhì)量的差異較大。

3.2 兩種牛肝菌多糖含量的測(cè)定

3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)苯酚—硫酸法，以水為對(duì)照，有關(guān)葡萄糖溶液的濃度與相應(yīng)的吸光度值如表2所示，可根據(jù)表中數(shù)據(jù)繪制出葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝3.1219x+0.0626，R2=0.9985,如圖1所示。

表2 葡萄糖溶液與相應(yīng)的吸光度值

圖 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，R2=0.9985滿足測(cè)定要求，且葡萄糖溶液的濃度與其吸光度值在測(cè)定的范圍內(nèi)存在較好的線性關(guān)系，可用于參照分析。

3.2.2 白牛肝菌及黑牛肝菌多糖含量測(cè)定

在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量?jī)煞N牛肝菌吸光度，并進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算，結(jié)果如表3所示。

表3 兩種牛肝菌多糖的含量及得率

由表3知，采用同種方法對(duì)黑、白兩種牛肝菌多糖進(jìn)行提取，白牛肝菌的多糖含量及多糖得率均比黑牛肝菌的高，且較為明顯。

4.3 牛肝菌多糖清除羥基自由基的能力分析

以羥基自由基清除試驗(yàn)Smirnoff的方法,在相同的條件下，分別對(duì)黑牛肝菌多糖、白牛肝菌多糖以及Vc的吸光度值進(jìn)行測(cè)定3次，并取相應(yīng)吸光度值的平均值，其數(shù)據(jù)記錄分別為表4、表5和表6，并根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，作出相應(yīng)的曲線圖，如圖2所示。

表4 黑牛肝菌多糖溶液對(duì)·OH清除率

圖 2 三種物質(zhì)的濃度與·OH清除能力

·OH清除率的計(jì)算（以黑牛肝菌多糖1.00 mL組為例）：

·OH清除率＝（1.023-0.650）/1.023×100%＝36.5%

同理：計(jì)算出黑牛肝菌多糖其他四組（2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL）的·OH清除率。以此方法，分別計(jì)算出白牛肝菌多糖和Vc相應(yīng)的·OH清除率。

由圖2看出，Vc和兩種牛肝菌多糖對(duì)·OH有顯著的清除作用，但三種物質(zhì)的濃度與·OH的清除能力不成正比關(guān)系。其中，Vc、黑牛肝菌多糖及白牛肝菌多糖隨著溶液濃度的增加，對(duì)·OH的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到10.338 μg/mL時(shí)，清除能力都達(dá)到最強(qiáng)，清除率分別為60.2%、43.4%和57.7%。隨后，隨著溶液濃度的增加，Vc和兩種多糖對(duì)·OH的清除能力也都逐漸減弱。白牛肝菌多糖對(duì)羥基自由基的清除能力比黑牛肝菌多糖的清除能力要強(qiáng)，稍弱于Vc的清除能力，但不失為較好的抗氧化新產(chǎn)物。

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（責(zé)任編輯 張 鐵）

A Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Porcini Polysaccharide

ZHOU Yunbo, XU Huaichun, LIU Fang, CHEN Honghui (School of Chemistry and Engineering, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China)

In this study, the mushroom polysaccharides of two kinds of porcini (the wild black and white porcini) in Wenshan City have been extracted and determined by the water-extraction and alcohol-precipitation method and the phenol-sulfuric acid method. The antioxidant activity of the two kinds of porcini polysaccharides are evaluated and contrasted with vitamin C through their ability of scavenging hydroxyl radical. As the experimental results show, the polysaccharide content of the wild black and white porcini is about 17.3%, 29.6%, and the rate of extraction is about 0.44%, and 0.98%. Moreover, both black and white porcini polysaccharides have certain activities of scavenging hydroxyl radicals, which are linear with their concentration. When the concentration of black porcini and white porcini polysaccharide gets 10.338 μg/mL, they have the strongest scavenging power to hydroxyl radicals with the clearance of 43.4% and 57.7%. While both are lower than vitamin C’s.

wild Porcini; porcini polysaccharide; water-extraction and alcohol-precipitation; phenol-sulfuric acid method; antioxidant activity

TQ281

A

1674 - 9200（2017）03 - 0024 - 04

2017 - 03 - 17

周云波，女，河南固始人，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院副教授，主要從事天然產(chǎn)物及物理化學(xué)研究；徐懷春，男，云南華寧人，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院教授，主要從事有機(jī)化學(xué)研究；劉芳，女，云南宣威人，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院副教授，碩士，主要從事分析化學(xué)研究。