鐘 凌，陳 姣，黃曉兵，李焱鑫

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a．檢驗科;b．血液科，四川 成都 610072)

血漿氧化還原電位在造血干細胞移植術后移植物抗宿主病監(jiān)測中的臨床應用

鐘 凌a，陳 姣b，黃曉兵b，李焱鑫a

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a．檢驗科;b．血液科，四川 成都 610072)

目的 探討血漿氧化還原電位在監(jiān)測移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)中的臨床應用。方法隨訪2009年1月至2015年12月進行造血干細胞移植的患者59例，移植術后定期隨訪同時取空腹靜脈血，測定血漿氧化還原電位。正常對照組由59例健康體檢者組成。結果正常對照組血漿RP值為-56.2～-11.2 mV。42例未發(fā)生GVHD患者血漿RP值為-20.8～21.1 mV，RP值波動幅度△mV為4.4～11.3 mV。17例發(fā)生GVHD患者血漿RP值為10.6～38.8 mV，△mV為25.8～61 mV。急性GVHD I級患者血漿RP值為9.8～27.3 mV，II級為3.7～35.1 mV，III級為19.6～43.9 mV，IV級為25.4～49.5 mV。結論血漿RP值的變化與GVHD可能具有一定的關聯(lián)，且無創(chuàng)、簡便，適宜于臨床推廣。

氧化還原電位;血漿;造血干細胞移植;移植物抗宿主病

造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)目前已被廣泛應用于干細胞移植、生物免疫治療等領域［1］。移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)是 HSCT的主要障礙。由于免疫遺傳學差異，植入的免疫活性細胞被受者抗原致敏而增殖分化，直接或間接攻擊受者細胞，對受者產(chǎn)生炎癥反應，炎癥反應與HSCT后的GVHD的嚴重程度密切相關［2］。氧化應激增強與氧化抗氧化失衡在炎癥反應中發(fā)揮重要作用［3］。血漿氧化還原電位(redox potential，RP)是反映機體內的氧化還原水平較為直接的指標［4］，HSCT后GVHD的發(fā)生可能會伴隨血漿RP的改變，血漿RP的變化可在一定程度上反映GVHD的嚴重程度。

1 對象與方法

1.1 研究對象2009年1月至2015年12月在我院進行HSCT的患者59例，其中男39例，女20例，年齡21～48歲，年齡中位數(shù)39歲。移植術后隨訪15個月。正常對照組為同期59例健康體檢者，男39例，女20例，年齡20～50歲，年齡中位數(shù)38歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 用預冷肝素抗凝管采集患者清晨空腹靜脈血4 ml，1500 g離心20 min，分離出血漿，1 h內完成檢測。

1.2.2 RP檢測 采用IPJ-PrE穩(wěn)壓器，以鉑電極為工作電極(表面積3.3×10-2cm2)，Ag/AgCl為參比電極，測定血漿電位，記錄電位變化30 min。每次測定前均需預處理測定電極［5］。

1.2.3 移植術后隨訪 HSCT術后患者一個月內，每天進行RP檢測。頭三個月每周進行血常規(guī)檢查，每月進行骨髓形態(tài)學檢查、流式細胞術、肝腎功能常規(guī)檢查;術后第四個月起每月復查血常規(guī)，每3個月復查骨髓形態(tài)、流式細胞術、肝腎功能常規(guī)檢查。如有病情變化隨時復查，并進行相應的組織學檢查和免疫學檢查。急性GVHD的臨床分級標準參照Thomas標準［6］，慢性GVHD的臨床分級標準參照 Schulman［7］標準。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

正常對照組血漿RP值為-56.2～-11.2 mV，中位數(shù)-32.7 mV。隨訪期間未發(fā)生GVHD患者42例(男24例，女18例)，血漿RP值為-20.8～21.1 mV，中位數(shù)0.2 mV。未發(fā)生GVHD患者的RP值長期處于較低水平，且波動幅度較小，△mV為4.4～11.3 mV。HSCT后未發(fā)生GVHD的患者隨訪期內血漿RP值呈兩種變化:一種在觀察期內其RP值保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)較大范圍波動(圖1a);另一種在觀察期內其RP值出現(xiàn)波動，即向正值偏移，但波動幅度較小，小于 25 mV(圖 1b)［6］。

圖1 隨訪期內未發(fā)生GVHD患者的RP值變化趨勢 a:在觀察期內RP值保持平穩(wěn);b:在觀察期內RP值向正值偏移。

依據(jù)GVHD臨床診斷和分級標準，17例患者在HSCT后發(fā)生GVHD(男15例，女2例)，發(fā)生GVHD時的血漿RP值為10.6～38.8 mV，中位數(shù)24.6 mV(t=5.93，P＜0.05)，而且發(fā)生了較大幅度的波動，△mV為25.8～61 mV。

依據(jù)急性GVHD分級標準，將發(fā)生急性GVHD的患者分為I～IV級，I級患者血漿RP值9.8～27.3 mV，II級患者血漿RP值13.7～35.1 mV，III級患者血漿RP值19.6～43.9 mV，IV級患者血漿 RP值25.4～49.5 mV。但不同分級患者的血漿RP值變化情況與其臨床表現(xiàn)、治療效果變化情況相符合。分級較低患者在觀察期第15～18天血漿RP值出現(xiàn)正向波動，波動幅度△mV為39 mV，于第20天確診發(fā)生急性GVHD，I級;隨后予以治療，臨床表現(xiàn)和實驗室檢查指標趨向正常、穩(wěn)定，患者的血漿RP值也逐步減低(圖2a)。分級較高患者HSCT后血漿RP值處于較高水平，觀察期第8～11天陡然向正值波動，波動幅度△mV為58 mV，第11天確診發(fā)生急性GVHD，IV級;隨后其血漿RP值逐漸升高，GVHD的嚴重程度逐步增加，于第16天死亡(圖2b)。

圖2 隨訪期內發(fā)生GVHD患者RP值變化趨勢 a:在觀察期第15～18天血漿RP值出現(xiàn)正向波動，治療后血漿RP值逐步減低;b:HSCT后血漿RP值處于較高水平，觀察期第8～11天向正值波動，發(fā)生急性GVHD后血漿RP值逐漸升高，于第16天死亡。

3 討論

目前GVHD仍是HSCT尤其是異基因HSCT的主要障礙。GVHD不是一個單獨的疾病而是輸入受者體內的供者淋巴細胞對“異物”做出的正常反應，是由供者源免疫活性細胞介導的攻擊宿主細胞和器官的一種過度的炎癥反應。因此GVHD可在很多臨床條件下發(fā)生，并且急性IV級GVHD病死率幾乎達 100%。如何早期、及時、非侵入性地診斷GVHD已成為移植術后亟待解決的問題之一。

炎性細胞因子是誘導和維持臨床GVHD的中心環(huán)節(jié)，三階段細胞因子網(wǎng)絡失調是GVHD的病理生理學基礎:第一階段，輻射和化療導致受者組織的損傷和激活，活化細胞分泌炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素－1(IL-1);第二階段，供者T細胞的激活以Th1細胞因子IL-2、干擾素－γ(IFN-γ)的分泌為特征;第三階段，由 IFN-γ 致敏的單核巨噬細胞分泌 IL-1、IFN-α［9］。TNF-α 是一種可引起多種生物學效應的炎癥因子，包括直接誘導組織損害和引起代謝改變。植入同種異體骨髓和T細胞混合物的小鼠會發(fā)生嚴重的皮膚、腸和肺部損害，并伴有TNF-α水平升高，輸入其抗體可抑制靶器官損害，同時給予可溶性受體也可大大降低死亡率［10］。IL-1由激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生，具有許多與TNF-α相似的生物學活性。小鼠同種異體骨髓移植模型中將IL-1注入宿主，受鼠出現(xiàn)消耗綜合征，死亡率增加。在小鼠GVHD模型中，移植后連續(xù)10天給予IL-1受體拮抗劑，防止了大多數(shù)動物發(fā)生GVHD［11］。因此，過度的炎癥反應是GVHD的重要組成部分。

氧化應激是指體內促氧化與抗氧化這兩個拮抗體系之間的平衡失調，促氧化作用增強，所引起的一系列病理生理損害。在正常體內，促氧化/抗氧化處于一個平衡狀態(tài)，病理情況下，氧化作用超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，平衡被破壞，此時機體組織或細胞內氧自由基生成增加和/或清除能力降低，導致氧化物等在體內或細胞內蓄積而引起氧化損傷過程，由此造成脂質、蛋白質、細胞膜和DNA的損傷［12］。而炎癥反應與氧化應激有密不可分的關系，炎癥反應過程中各種炎癥因子會刺激氧化產(chǎn)物的生成，從而產(chǎn)生更多的超氧化物，破壞促氧化/抗氧化的平衡［13～16］。血液中的RP是反應機體內促氧化/抗氧化狀態(tài)最直接的指標，因此選用血漿RP來反映HSCT后患者的炎癥狀態(tài)［12］。

有學者嘗試通過測定RP值來檢測血液和其他生物體液、組織的RP［11］，并研究了RP測定方法的改進和結果的解釋等［17～19］。但是，由于在生物媒介中沒有獨立的、統(tǒng)一的RP值測量方法，包括測量電極的選擇(鉑金、黃金或碳)，因此，不同研究者獲得的數(shù)據(jù)在比較分析時的可靠性上存在問題［8］。Michael等［13］通過分析礦物鹽溶液中鉑電極表面上發(fā)生的化學過程的機制，發(fā)現(xiàn)了某些影響RP值測量的因素。從電化學的角度講，所謂的生物媒介的RP值是通過測定浸入目的媒介中的鉑電極的開路電位值來確定的。這一整體性特質，大致上反映了內穩(wěn)態(tài)的氧化還原平衡狀態(tài)。因此，測量RP為正數(shù)值表示一個平衡向氧化形式轉變，這可能表明即將發(fā)生氧化應激的可能性，同樣，轉向負值的RP值表明抗氧化劑的優(yōu)勢及在體內平衡中氧化過程的化學貢獻的相應減少［20～23］?，F(xiàn)已證明測量PR值時主要的錯誤來源在于在測量時鉑電極表面氧化組分的改變，Michael等改進了鉑電極的預處理方法，從而極大地提高了RP數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性［8，24］。本研究中對血漿RP的測量，采用了Michael改進后的方法，以確保檢測數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性和可比性。

本研究結果顯示，正常對照組、未發(fā)生GVHD組、發(fā)生GVHD組之間血漿RP值存在差異，表明血漿RP用于HSCT患者術后是否發(fā)生GVHD，具有一定的診斷價值，且不同分級患者的血漿RP值變化情況與其臨床表現(xiàn)、治療效果變化情況可能有關。

基于RP數(shù)據(jù)分析及研究對象的臨床表現(xiàn)的比較，我們可以看到，正向的RP值的改變范圍大于25 mV(與監(jiān)測過程中的初始值進行比較)，表明移植術并發(fā)癥或移植功能障礙如移植排斥反應的開始。一般改變的范圍大小反映了并發(fā)癥的嚴重性。而且上述改變通常先于移植機能障礙或急性排斥反應的臨床癥狀出現(xiàn)之前，也先于血液標志物的改變(例如血常規(guī)、骨髓形態(tài)學檢查、流式細胞術、肝腎功能常規(guī)檢查等)，這一點對于患者發(fā)生移植術后并發(fā)癥的早期診斷具有重要的臨床價值。

由于本研究納組病例數(shù)有限，因此較難確定血漿RP值正常參考范圍，有待進一步擴大研究病例以確定RP的正常值范圍、移植術后監(jiān)測GVHD的標準。但RP在移植術后并發(fā)癥的早期提示和病情評估方面的臨床價值，已經(jīng)有了初步的體現(xiàn)。

綜上所述，血漿RP值的檢測，可在一定程度上提示HSCT術后發(fā)生GVHD的風險，其變化與患者臨床表現(xiàn)、治療效果的變化具有相關性，并且該方法簡便、無創(chuàng)、適于臨床推廣。

［1］Klein AA，Lewis CJ，Madsen JC，et al．Organ transplantation．a(chǎn) clinical Guide［M］．New York:Cambridge University Press，2011．

［2］Ferrara JLM，Cook KR，Teshima T．The pathophysiology of Graft-versus-Host-Disease in:Graft-versus-Host-Disease［M］．Ed．3 th．New York:Marcel Dekker，2005:1-34．

［3］Li Z，Chen L，Rubinstein MP．Cancer immunotherapy:are we there yet［J］．Exp Hematol Oncol，2013，2(1):33．

［4］Ratajczak MZ．A novel view of the adult bone marrow stem cell hierarchy and stem cell trafficking［J］．Leukemia，2015，29(4):776-782．

［5］Khubutiya MS，Evseev AK，Kolesnikov VA，et al．Measurements of platinum electrode potential in blood and blood plasma and serum［J］．Russ J Electrochem，2010，46:537．

［6］Johnsen HE，Beatty PG，Thomas ED，et al．Donor alloreactivity may predict acute graft-versus-host disease in HLA-matched bone marrow transplantation for leukemia in early remission［J］．Eur J Haematol，1992，48(5):249-253．

［7］Schulman V，Ayash L，Lazarus H M，et al．Chronic graft-versus-host disease:clinical manifestation and therapy［J］．Bone Marrow Transplant，2001，28(6):121-122．

［8］Michael MG，Mogely SK，Anatoly KE，et al．Noninvasive diagnosis of dysfunctions in patients after organ transplantation by monitoring the redox potential of blood serum［J］．Transplantation，2015，99(6):1288-1292．

［9］Gupta A，Punatar S，Gawande J，et al．Risk Factors，Pattern and Clinical outcome of acute graft versus host disease in acute leukemia patients undergoing allogeneic stem cell transplant［J］．Indian J Hematol Blood Transfus，2015，31(4):404-412．

［10］Lee DA．The off-target effects of nonspecific NK cells［J］．Blood，2015，125(5):744-745．

［11］Lu L，Lan Q，Li Z，et al．Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(33):3432-40．

［12］Goldin MM，Volkov AG，Khubutiya MSh，et al．Redox potential measurement in aqueous solutions and biological media［J］．ECS Transactions，2008，11:39．

［13］Michaelis L．Oxidation-reduction potentials［M］．Philadelphia:JB Lippincott Company，1930:128-131．

［14］Ziegler E．The Redox Potential of the Blood In Vivo and In Vitro［M］．Illinois:Charles C，Thomas Publ，1965．

［15］Guo W，Dong A，He M，et al．A Meta-Analysis for Effects of Elevated Pre-Transplantation Serum Ferritin on the Outcomes in Patients Undergoing Hematopoietic Stem Cell Transplantation［J］．Cancer Invest，2016，3:1-8．

［16］Zhang XH，Wang QM，Chen H，et al．Clinical characteristics and risk factors of Intracranial hemorrhage in patients following allogeneichematopoietic stem cell transplantation［J］．Ann Hematol，2016，95(10):1637-1643．

［17］Marmasse C，Grosz HJ．Direct experimental evidence of a functionally active electron transport system in human blood［J］．Nature，1964，202:94．

［18］Grosz HJ，F(xiàn)armer BB．Reduction-oxidation potential of blood as a function of partial pressure of oxygen［J］．Nature，1967，213:717．

［19］White NJ，Collinson MM，Boe RA，et al．Redox monitoring reveals increased susceptibility of whole blood to oxidative stress during hemorrhagic shock［J］．Circulation，2008，118:1488．

［20］Tsai AG，Cabrales P，Intaglietta M．The physics of oxygen delivery:facts and controversies［J］．Antioxid Redox Signal，2010，12(6):683-691．

［21］Garber HR，Mirza A，Mittendorf EA，et al．Adoptive T-cell therapy for Leukemia［J］．Mol Cell Ther，2014，2:25．

［22］Khubutiya MSh，Goldin MM，Romasenko MV，et al．Redox potentials of blood serum in patients with acute cerebral pathology［J］．ECS Transactions，2010，25:63．

［23］Sergienkol VI，Khubutiya MSh，Evseev AK，et al．Diagnostic and prognostic possibilities of the redox-potential electrochemical measurements in blood plasma［J］．Vestn Ross Akad Med Nauk，2015，6:627-632．

［24］Rael LT，Bar-Or R，Aumann RM，et al．Oxidation-reduction potential and paraoxonase-arylesterase activity in trauma patients［J］．Biochem Biophys Res Commun，2007，361:561．

Clinical application of the redox potential of blood plasma in monitoring GVHD after HSCT

ZHONG Linga，CHEN Jiaob，HUANG Xiao-bingb，LI Yan-xina(a．Clinical Laboratory，b．Department of Hematology，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To investigate the clinical application of Redox potential of blood plasma in monitoring graft-versus-host disease(GVHD)after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)．MethodsWe followed up 59 patients accepted HSCT from Jan 2009 to Dec 2015．During the regular follow-up after HSCT，fasting venous blood samples were taken and redox potential(RP)in blood was measured．At the same time，59 healthy subjects were used as normal control．ResultsThe plasma RP values were-56.2～ -11.2 mV in normal control group．The plasma RP values were-20.8～21.1 mV in 42 patients who did not have GVHD during the period of follow-up．The fluctuation range(△mV)were in 4.4～11.3 mV．The plasma RP values were 10.6～38.8 mV and △mV were 25.8～61 mV in 17 patients who had GVHD．The RP values were 9.8～27.3 mV，13.7～35.1 mV，19.6～43.9 mV and 25.4～49.5 mV in patients with I to IV degree of acute GVHD，respectively．ConclusionThe changes of blood plasma PR values may be associated with GVHD．The measurement of PR value is invasive and simple that is suitable for promotion．

Redox Potential;Plasma;HSCT，GVHD

R446.62

A

1672-6170(2017)04-0033-04

2016-11-18;

2017-03-24)