維生素C和維生素E與蛹蟲草聯(lián)用對(duì)大鼠免疫調(diào)節(jié)的影響

盛曉蕾　陳祥翠　黎紅維

摘 要：蛹蟲草具有抗疲勞、提高機(jī)體免疫力的作用，維生素E具有抗氧化，清除體內(nèi)氧自由基，免疫調(diào)節(jié)的作用。維生素C具有強(qiáng)還原性，與維生素E在免疫調(diào)節(jié)上具有正向協(xié)同作用。該研究使用8周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練建立大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型，分為空白對(duì)照組（CK）、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（CKY）、運(yùn)動(dòng)+蛹蟲草組（YCC）、運(yùn)動(dòng)+蛹蟲草+維生素C+維生素E組（YCE）4組。運(yùn)動(dòng)第8周后，取全血提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用qRT-PCR檢測(cè)IL-2的表達(dá)量，并做qRT-PCR的電泳圖檢測(cè)IL-2的片段大小。結(jié)果表明，8周大鼠遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后CKY組的IL-2表達(dá)量與CK組相比顯著降低，YCC組表達(dá)量接近相同，YCE組表達(dá)量明顯增高。根據(jù)電泳圖顯示，各組IL-2的條帶大?。?00bp）均與內(nèi)參基因GAPDH大小一致，且沒有明顯的引物二聚體。維生素C和維生素E與蛹蟲草聯(lián)用能促進(jìn)IL-2的表達(dá)，維生素C和維生素E對(duì)蛹蟲草的免疫調(diào)節(jié)是正向協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：IL-2；蛹蟲草；維生素C；維生素E；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類號(hào) R29 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）14-0048-03

Abstract：Cordyceps militaris has anti-fatigue， improve the body immunity， vitamin E has antioxidant， remove the body free radicals， immune regulation， vitamin C has a strong reduction， and vitamin E in the immune regulation has a positive synergistic effect. Blank control group（CK）， exercise control group （CKY）， exercise + Cordyceps militaris group（YCC）， exercise + Cordyceps militaris + vitamin C + vitamin E group （YCE） 4 groups. The expression of IL-2 was detected by qRT-PCR and the size of IL-2 was detected by electrophoretic pattern detection. The results showed that the expression of IL-2 in CKY group was significantly lower than that in CK group， and the expression level of YCC group was similar to that of YCC group. YCE group expression was also significantly increased. According to the electrophoregram， the bands of IL-2 in each group were consistent with the size of GAPDH， and there was no obvious primer dimer. Vitamin C and vitamin E combined with Cordyceps militaris can make IL-2 expression up-regulated， vitamin C and vitamin E on the immune regulation of Cordyceps militaris is a positive synergistic effect.

Key words：IL-2；Cordyceps militaris；Vitamin C；Vitamin E；Immunomodulation

免疫功能低下是一種病理特征，人體免疫力就是我們的身體在面對(duì)外來的侵襲時(shí)所能抵御其侵害的能力。在機(jī)體面對(duì)外來感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基抵御感染。同時(shí)，大量的氧自由基也損害了自身的免疫細(xì)胞[1]。比如無處不在的細(xì)菌、病毒向人體進(jìn)攻時(shí)，身體抵抗能力的好與壞直接決定了是否會(huì)被感染。免疫功能降低的癥狀包括：經(jīng)常發(fā)生傷風(fēng)和流感，經(jīng)常治愈的寄生蟲感染又復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病都與過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，免疫功能降低，抗氧化營養(yǎng)素，如維生素C、維生素E等有消除自由基的抗氧化作用，抗氧化維生素對(duì)免疫調(diào)節(jié)可以彌補(bǔ)和提高機(jī)體的免疫反應(yīng)[2]。同時(shí)一些抗氧化素有協(xié)同作用。

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草、北蟲草[3]，其主要成分是蟲草多糖，具有提高免疫力，延緩衰老、扶正固體、保護(hù)心臟、肝臟、抗癌的作用。蛹蟲草提取物具有調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用，可減輕內(nèi)毒素或類似物質(zhì)引起的炎癥，具有一定的免疫保護(hù)作用[4]。國內(nèi)外研究證實(shí)，蛹蟲草的機(jī)制主要?dú)w功于免疫調(diào)節(jié)[3-5]。

維生素E是生育酚和三烯生育酚的總稱，是一種脂溶性維生素，具有很強(qiáng)的抗氧化和清除氧自由基的效果[2]。維生素E在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是抗氧化，防止細(xì)胞內(nèi)和膜內(nèi)的不飽和脂肪酸被氧化而破壞，保證其完整性[6]。維生素E在正常的免疫功能中發(fā)揮作用，尤其是對(duì)于淋巴細(xì)胞，這一作用已經(jīng)在動(dòng)物模型和美國老年人群中得到證實(shí)[7]。

維生素C有L型和D型2種異構(gòu)體，只有L型具有生理功能，還原型和氧化型都具有生理活性[8]。維生素C是一種水溶性維生素，最重要的是強(qiáng)還原性的分子特征，并與維生素E產(chǎn)生協(xié)同作用，降低脂質(zhì)過氧化、超氧化物歧化酶的生成，保護(hù)超氧化酶活性，清除氧自由基，提高機(jī)體免疫功能[8]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，具有有規(guī)律的中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的人群壽命和生活質(zhì)量優(yōu)于很少或者不運(yùn)動(dòng)人群[9]。然而，由于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性免疫機(jī)能失衡，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)人群，尤其在中老年階段仍進(jìn)行大強(qiáng)度訓(xùn)練可能降低生活質(zhì)量和縮短壽命[9]。在運(yùn)動(dòng)免疫領(lǐng)域，由運(yùn)動(dòng)員高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞免疫失衡和Th1/Th2免疫失衡的抑制，在免疫水平的維持引起過度的注意[10-11]。

白細(xì)胞介素2（IL-2）：分子量為1.5萬的糖蛋白，對(duì)T細(xì)胞激活及生長起著重要作用[12]。IL-2是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，并參與抗腫瘤效應(yīng)和移植排斥反應(yīng)[13]。IL-2可將B細(xì)胞分化成可產(chǎn)生活化細(xì)胞免疫球蛋白的細(xì)胞[14]。

本研究采用跑臺(tái)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)建立大鼠疲勞模型，通過qRT-PCR檢測(cè)II-2的表達(dá)量及電泳圖檢測(cè)IL-2片段的大小進(jìn)行結(jié)果分析。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只四周齡SD雌性大鼠，由北京通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證：SCXK（京）。

1.1.2 儀器與試劑 LDZM立式壓力滅菌器：由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；實(shí)時(shí)定量PCR儀：設(shè)備型號(hào)FQD-96A；PCR儀：型號(hào)GD35-TP600；電泳儀：由北京市六一儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)DYY-6C型；冷CCD凝膠成像分析儀：型號(hào)GL；IL-2總RNA的提取試劑盒，維生素C泡騰片：拜耳醫(yī)藥保健公司，規(guī)格：1000mg/片，批號(hào)H20056946；維生素E軟膠囊：浙江醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：100mg/粒，批號(hào)：H33020187；蛹蟲草：湖北眾菇善年生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 疲勞型大鼠模型的建立，疲勞是指機(jī)體生理過程不能持續(xù)其機(jī)能在一定水平上，或不能維持特定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[13]。在研究運(yùn)動(dòng)疲勞和恢復(fù)過程中，疲勞是研究運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生和恢復(fù)的先決條件。大鼠疲勞模型的建立主要是以跑步機(jī)為訓(xùn)練模式。根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)研究的需要，建立不同時(shí)期的疲勞模型。大部分受訓(xùn)是7周遞增負(fù)荷跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)模式，大鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷遞增，第7周訓(xùn)練開始力竭。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)主要有大鼠跟不上實(shí)驗(yàn)預(yù)定速度，表現(xiàn)為臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30s以上；對(duì)連續(xù)的光、聲、機(jī)械刺激無反應(yīng)；出現(xiàn)呼吸深急，精神疲憊，俯臥位垂頭，刺激后無反應(yīng)等行為特征[10]。值得注意的是，在實(shí)際建模過程中，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)具體情況適當(dāng)調(diào)整運(yùn)動(dòng)負(fù)荷或運(yùn)動(dòng)時(shí)間。本研究參照上海體育學(xué)院王茹，陳佩杰[15]等的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型進(jìn)行訓(xùn)練設(shè)計(jì)。具體的跑臺(tái)訓(xùn)練負(fù)荷見表1。

將買回來的大鼠放在飼養(yǎng)室飼養(yǎng)7d，讓其適應(yīng)飼養(yǎng)室的環(huán)境。7d后按照本實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分成4個(gè)組，每組6只。空白對(duì)照組（CK）：置于籠中自然生長，不參與跑臺(tái)訓(xùn)練，在其他組訓(xùn)練完后同時(shí)給予與蛹蟲草組相同劑量的0.9%生理鹽水；訓(xùn)練對(duì)照組（CKY）：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)疲勞模型，進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，并在跑臺(tái)訓(xùn)練后即刻灌胃與蛹蟲草組相同劑量的0.9%生理鹽水；訓(xùn)練+蛹蟲草組（YCC）：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)疲勞模型，進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，并在每次跑臺(tái)訓(xùn)練后即刻灌胃蛹蟲草水溶液（按照蛹蟲草400mg/kg體重計(jì)算）；訓(xùn)練+蛹蟲草+VC+VE組（YCE）：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)疲勞模型，進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，并在每次跑臺(tái)訓(xùn)練后即刻灌胃蛹蟲草+VC+VE水溶液（按照蛹蟲草400mg/kg、VC和VE均是5.0mg/kg體重計(jì)算），自由進(jìn)食飲水。

經(jīng)過8周的遞增負(fù)荷訓(xùn)練建立疲勞模型，第九周從大鼠眼眶后靜脈從取其全血。將同一組的大鼠全血各取1mL于一個(gè)新的離心管中充分混合，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA，放在-20℃?zhèn)溆?。?yīng)用Premier Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物質(zhì)量檢測(cè) 圖1中2、3、4、5泳道是GAPDH內(nèi)參基因，6、7、8、9泳道是IL-2基因。從PCR瓊脂糖凝膠電泳圖中可以清晰的看出IL-2與內(nèi)參條帶大小都為單一的條帶，無明顯引物二聚體，說明引物質(zhì)量可靠，可用于qRT-PCR研究。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 從圖2可以看出，以CK組的IL-2的表達(dá)作為參照，CKY組的IL-2表達(dá)倍數(shù)顯著減少；YCC組的IL-2表達(dá)倍數(shù)比CK組IL-2的表達(dá)倍數(shù)略高；YCE組的IL-2表達(dá)倍數(shù)比CK組IL-2的表達(dá)倍數(shù)顯著增高。

3 討論

長期堅(jiān)持低中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)會(huì)提高機(jī)體健康、生活質(zhì)量，延長壽命等。但是大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性機(jī)體免疫平衡失調(diào)，降低機(jī)體健康水平。低等強(qiáng)度訓(xùn)練初期運(yùn)動(dòng)有助于大鼠免疫力的提高，各運(yùn)動(dòng)組大鼠體重及其飲食量與飼養(yǎng)時(shí)間成正相關(guān)增長。但是隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增大，破壞了運(yùn)動(dòng)組大鼠免疫系統(tǒng)的平衡，在沒有給予任何提高機(jī)體免疫力藥物的CKY組大鼠出現(xiàn)一系列如體重增長緩慢、進(jìn)食量減少、毛發(fā)凌亂、打噴嚏、對(duì)外界刺激敏感性降低等現(xiàn)象。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后會(huì)造成大鼠免疫力的減弱，蛹蟲草基本可以抵抗大鼠大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后疲勞引起的免疫調(diào)節(jié)能力降低，而維生素C和維生素E與蛹蟲草聯(lián)用不僅可以抵抗大鼠高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)疲勞引起的免疫調(diào)節(jié)能力低下，還能在一定程度上增強(qiáng)大鼠的免疫調(diào)節(jié)能力。

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（責(zé)編：張宏民）