“新葡7號(hào)”葡萄胚挽救影響因素的研究

胡學(xué)林　朱婉婷　錢(qián)文婕

摘 要：該文以“新葡7號(hào)”的胚珠為試材，研究不同培養(yǎng)基、不同IBA濃度和胚處理方式對(duì)“新葡7號(hào)”葡萄的胚發(fā)育的影響。結(jié)果表明，在供試的3種培養(yǎng)基中，以Nitsch最適宜于“新葡7號(hào)”的胚珠發(fā)育，ER培養(yǎng)基次之，IBA最適宜濃度為1.0mg/L。最終確定開(kāi)花后30d為“新葡7號(hào)”最佳取樣時(shí)間，最佳胚珠發(fā)育體系為Nitsch培養(yǎng)基+IBA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L，2%蔗糖，0.6%瓊脂組成。

關(guān)鍵詞：新葡7號(hào)；胚挽救；胚發(fā)育；因素

中圖分類(lèi)號(hào) S66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 1007-7731（2017）14-0058-03

“新葡7號(hào)”是新疆主栽品種“無(wú)核白”葡萄的芽變品種，2012年8月通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)作物品種登記[1]，無(wú)核白，果實(shí)無(wú)核、皮薄、肉脆、汁水多，是深受歡迎的制干和鮮食品種[2]?！靶缕?號(hào)”果粒較無(wú)核白大，無(wú)核，早中熟品種，果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量都優(yōu)于無(wú)核白。胚挽救技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，極大地拓寬了葡萄育種的范圍和效率，利用胚挽救技術(shù)對(duì)本地特色葡萄品種進(jìn)行改良已成為最有效的途徑之一。本研究旨在應(yīng)用胚挽救技術(shù)探索適宜“新葡7號(hào)”的培養(yǎng)基及最佳取樣接種時(shí)期等影響因素，以期進(jìn)一步提高選育新的無(wú)核葡萄品種的效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 2015—2017年在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 研究方法

1.2.1 物候期觀(guān)察 “新葡7號(hào)”在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)進(jìn)行，較本地?zé)o核白葡萄提前10～15d，4月中旬萌芽，5月中旬開(kāi)花，8月上旬成熟，生育期110d。

1.2.2 幼果重量及胚珠的生長(zhǎng)變化 開(kāi)花后20d，每隔5d取樣1次，采集的幼果樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)抽取30粒果粒測(cè)定幼果重及胚珠重量和縱橫徑，確定最佳取樣時(shí)間。

1.2.3 胚珠培養(yǎng) 發(fā)育培養(yǎng)基以MS、ER、Nitach為基本培養(yǎng)基，附加GA及IBA、6-BA等激素，篩選出適于“新葡7號(hào)”胚挽救的最佳幼胚發(fā)育培養(yǎng)基、IBA濃度。萌發(fā)培養(yǎng)基Nitsch+IBA 1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+GA 0.5mg/L，2% 蔗糖，0.6% 瓊脂組成，確定最佳胚珠處理方式。

1.2.4 接種 接種方式參照王躍進(jìn)等[3]的方法。先用自來(lái)水將果穗沖洗30～45min，然后用70%酒精浸泡30～60s，無(wú)菌水沖洗3～4次，再將果穗放入0.1%升汞中浸泡6～8min，再用無(wú)菌水漂洗4～6次，將消毒后的果粒切開(kāi)，取出胚珠，接種于內(nèi)裝50mL培養(yǎng)基的150mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種20枚胚珠，每處理5瓶，置培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25±1℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，每天照明12～14h。胚珠培養(yǎng)60～70d后將胚珠進(jìn)行切喙或橫切處理，轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)發(fā)育胚珠數(shù)和萌發(fā)胚珠數(shù)，以胚珠轉(zhuǎn)綠、膨大為發(fā)育胚珠，褐化干枯的為未發(fā)育。胚珠萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)胚珠數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS程序進(jìn)行鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣時(shí)間對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響 6月5日開(kāi)始（開(kāi)花后20d），每隔5d取樣1次，采集的幼果樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)抽取30粒果粒測(cè)量的幼果及胚珠重量和縱、橫徑。再對(duì)自然授粉的果穗取樣培養(yǎng)。結(jié)果表明（圖1、圖2）：幼果重、胚珠縱橫徑隨著時(shí)間呈現(xiàn)不斷增大的趨勢(shì)，到6月20日（開(kāi)花后35d）胚珠質(zhì)量、縱徑、橫徑達(dá)到最大值，分別為8.1mg，0.462cm，0.217cm；6月25日（開(kāi)花后40d）后幼果重量保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，而胚珠質(zhì)量、縱橫徑出現(xiàn)降低趨勢(shì)。說(shuō)明在幼果生長(zhǎng)到一定程度，胚珠出現(xiàn)生長(zhǎng)停止和減緩的趨勢(shì)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，胚珠在這個(gè)時(shí)間處于敗育時(shí)期。

將不同時(shí)期采集的幼果進(jìn)行胚培養(yǎng)，結(jié)果表明（表1），胚珠發(fā)育率最高出現(xiàn)在6月15日（開(kāi)花后30d），發(fā)育率為30%，胚珠質(zhì)量為5.1mg；30d后隨著幼果重量不斷增大，胚珠發(fā)育率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，6月20日（開(kāi)花后35d），胚珠發(fā)育率14%，重量達(dá)到8.1mg。胚珠在開(kāi)花后30d之內(nèi)保持最高的發(fā)育率，說(shuō)明6月15日為“新葡7號(hào)”葡萄胚挽救最佳取樣時(shí)期。

2.2 不同培養(yǎng)基與激素對(duì)胚培養(yǎng)的影響 對(duì)“新葡7號(hào)”葡萄的胚發(fā)育培養(yǎng)的結(jié)果表明（表2），發(fā)育培養(yǎng)基以MS、ER、Nitach為基本培養(yǎng)基，分別接種300粒胚珠，3種發(fā)育培養(yǎng)基Nitach和BR培養(yǎng)基差異不顯著，Nitach培養(yǎng)基的發(fā)育率最高，為60.2%，BR培養(yǎng)基發(fā)育率次之，為57.3%，MS培養(yǎng)基發(fā)育率為25.7%，較Nitach、BR培養(yǎng)基差異顯著。說(shuō)明Nitach培養(yǎng)基更優(yōu)于BR、MS培養(yǎng)基，更適合運(yùn)用于“新葡7號(hào)”葡萄的胚挽救研究。

2.3 不同激素濃度、不同處理方式對(duì)胚發(fā)育的影響 在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度IBA生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)胚發(fā)育的影響，結(jié)果表明（表3）：生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA的不同濃度對(duì)胚珠的發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響，IBA濃度在1mg/L的胚珠發(fā)育率較高，為61.7%，IBA濃度在0.51mg/L和1.51mg/L的胚珠發(fā)育率低于濃度為1mg/L。

2.4 不同處理方式對(duì)胚萌發(fā)的影響 通過(guò)不同培養(yǎng)基、不同濃度的IBA對(duì)“新葡7號(hào)”葡萄胚珠進(jìn)行培養(yǎng)得到發(fā)育胚，按橫切和切喙的方式對(duì)發(fā)育胚進(jìn)行處理后繼續(xù)培養(yǎng)30d得到正常苗。根據(jù)結(jié)果表明（表4）：2種處理方式得到的萌發(fā)率較不做處理的萌發(fā)率高，經(jīng)過(guò)橫切的胚珠萌發(fā)率為42.9%，經(jīng)過(guò)切喙的胚珠萌發(fā)率為62。8%，不做處理的只有6%。說(shuō)明胚珠經(jīng)過(guò)處理后可以提高胚的萌發(fā)率，使用切喙的方式進(jìn)行處理發(fā)育胚得到高的萌發(fā)率。

4 結(jié)論與討論

4.1 取樣時(shí)時(shí)間對(duì)胚生長(zhǎng)發(fā)育的影響 研究胚生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，確定胚珠接種的最佳時(shí)期是胚挽救成功的前提。唐冬梅發(fā)現(xiàn)在較晚的時(shí)期接種，胚發(fā)育的程度越高，培養(yǎng)效果更好，成苗率較高，在早期，胚的發(fā)育程度低，離體培養(yǎng)胚不易成活[4]。王躍進(jìn)等對(duì)5個(gè)種內(nèi)和種間雜交組合及3個(gè)自然授粉的無(wú)核品種研究表明，不同品種及雜交組合胚挽救的最佳取材時(shí)期一般介于授粉后20～50d[5]。掌握最佳的接種時(shí)期是提高胚珠培養(yǎng)成功率的關(guān)鍵。研究表明“新葡7號(hào)”葡萄幼果重、胚珠重量和縱橫徑隨著時(shí)間呈現(xiàn)不斷增大的趨勢(shì)，開(kāi)花后30d胚珠發(fā)育率到達(dá)最大值，而開(kāi)花后35d胚珠質(zhì)量、縱橫徑達(dá)到最大值，開(kāi)花后40d胚珠重量、縱橫徑顯現(xiàn)降低趨勢(shì)，與前人研究不同。郝燕等認(rèn)為最佳接種時(shí)間要根據(jù)各品種的胚珠發(fā)育狀況來(lái)確定，通常在胚珠重量最大期來(lái)確定[6]。而本項(xiàng)目的研究胚珠發(fā)育率到達(dá)最大值后的第5天的胚珠質(zhì)量、縱橫徑達(dá)到最大值。因此，確定最佳采樣時(shí)間不能只考慮胚珠重量，而是考慮品種、氣候等綜合因素。

4.2 影響葡萄胚培養(yǎng)的主要因素 葡萄胚培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有ER[7]、MS、Nitach[8]、B5[9]、1/2MS[10]。本研究試料為“新葡7號(hào)”，Nitach培養(yǎng)基更優(yōu)于BR、MS培養(yǎng)基，更適合運(yùn)用于“新葡7號(hào)”葡萄的胚挽救研究。這與夏培蓓研究白木納格葡萄胚挽救的結(jié)果一致[11]。生長(zhǎng)素是影響胚珠發(fā)育的重要激素，生長(zhǎng)素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，本項(xiàng)目選用IBA作為試料，結(jié)果表明IBA濃度在1mg/L的胚珠發(fā)育率較高，為61.7%。適合的IBA濃度會(huì)促進(jìn)“新葡7號(hào)”胚珠發(fā)育，濃度過(guò)低起不到促進(jìn)作用，過(guò)高又會(huì)抑制發(fā)育。胚珠經(jīng)過(guò)處理后可以提高胚的萌發(fā)率，使用切喙的方式進(jìn)行處理發(fā)育胚得到高的萌發(fā)率。通過(guò)以上研究，確定了30d為“新葡7號(hào)”最佳取樣時(shí)間，最佳胚珠發(fā)育體系為Nitsch培養(yǎng)基+IBA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L，2%蔗糖，0.6%瓊脂組成。

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