石從廣，高燕會，柳新紅，李因剛，楊少宗，蔣冬月，朱光權(quán)

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

3種安息香屬植物的根尖染色體核型分析

石從廣1，高燕會2，柳新紅1，李因剛1，楊少宗1，蔣冬月1，朱光權(quán)1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

2013年9月和10月，在浙江省杭州市采集芬芳安息香Styrax odoratissimus，越南安息香S. tonkinensis和賽山梅S. confusus種子，砂藏至翌年發(fā)芽，待根長至3 ～ 5 cm時，對3種安息香屬植物的根尖進(jìn)行染色體制片和核型分析。結(jié)果顯示，3樹種均為二倍體，體細(xì)胞染色體數(shù)均為2n=2x=16。芬芳安息香核型公式為2n=16=10 m +6 sm（2 sat），核不對稱系數(shù)為58.20%，染色體核型為2A型；越南安息香核型公式為2n=16=12 m（1 sat）+4 sm （2 sat)，核不對稱系數(shù)為53.27% ，染色體核型為1A型；賽山梅染色體核型公式為2n=16=12 m（1sat）+4 sm，核不對稱系數(shù)為56.54%，染色體核型為1A型。表明越南安息香和賽山梅核型較為類似，親緣關(guān)系較近，與芬芳安息香之間差別較大，芬芳安息香比越南安息香和賽山梅進(jìn)化程度較高。3種安息香屬植物染色體核型均為A型，表明其進(jìn)化地位較低，植物較為原始。

安息香屬；染色體；核型分析；二倍體；進(jìn)化

安息香科 Styracaceae 安息香屬 Styrax 植物分布于亞洲東部、美洲北部和西部及地中海地區(qū)，在我國主產(chǎn)于長江流域以南各省區(qū)[1-2]。浙江有12種和1變種，其中的越南安息香 Styrax tonkinensis又叫白花樹，落葉喬木，浙江省泰順縣有分布，其樹脂稱“安息香”，為貴重藥材，種子油可供藥用，也是制生物柴油的優(yōu)良原料。越南安息香是本屬中研究較多的樹種，研究內(nèi)容主要包括形態(tài)和物候以及大小孢子（配子體）等生物學(xué)特征研究[3-5]；地理分布、引種栽培、氣候群落特征、以及天然群體遺傳多樣性研究[6-9]；種仁和種子油的營養(yǎng)成分分析[10-11]、苗木繁育[12]，定向撫育栽培[13]和種子成熟期脂肪酸變化規(guī)律[14]、種子油脂毒理學(xué)初步評價[15]以及利用種子油制備生物柴油等[16-17]；木材加工利用及園林應(yīng)用等[18-19]。該屬的芬芳安息香S. o doratissima和賽山梅S. confusus，都是浙江較為常見的落葉灌木或小喬木，目前只有利用催化劑對提取的賽山梅種子油催化制備生物柴油的報道[20]。

通過對越南安息香、芬芳安息香和賽山梅的根尖進(jìn)行染色體制片和核型分析，研究這3個種種間的遺傳變異和親緣關(guān)系，為雜交育種以及雜種后代鑒定等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為芬芳安息香、越南安息香和賽山梅的種子。其中芬芳安息香和賽山梅的種子采自浙江省杭州市西湖區(qū)午潮山，野生種；越南安息香種子采自杭州市西湖區(qū)浙江省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃地，是從江西省吉安市吉水縣引種栽培的第二代種子。

芬芳安息香在2013年9月下旬種子成熟后采種，賽山梅和越南安息香在2013年10月上旬采種，采下的果實經(jīng)風(fēng)干開裂后脫粒去果殼。2013年12月，將3種種子分別沙藏至第二年春天發(fā)芽，待根長至3 ～ 5 cm時，于8：30－9：30，每種各取25 ～ 30株芽苗，用解剖刀截取長約0.5 c m的根尖，放入飽和對二氯苯中，28℃處理2.5 ～ 3.0 h，水洗并經(jīng)無水乙醇：冰乙酸（3：1）固定24 h，保存于70%酒精中于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將固定好的根尖? mol·L-1HCI，65℃水浴解離10 min，在載玻片上染色體制片，在萊卡顯微鏡觀下觀察并拍照。

1.2 染色體計數(shù)和核型分析

取染色體分散良好、著絲點清晰的中期分裂相進(jìn)行染色體計數(shù)，結(jié)合圖形分析處理軟件Photoshop CS3進(jìn)行處理計數(shù)，測量染色體長臂及短臂長度，再用Excel計算染色體相對長度、相對長度系數(shù)、臂比、核型不對稱系數(shù)，計算思路與公式如下。

1.2.1 染色體計數(shù) （1）每種統(tǒng)計50個以上可準(zhǔn)確計數(shù)染色體的細(xì)胞，以確認(rèn)其染色體數(shù)目；（2）分別從5個以上根尖壓片中，選擇次縊痕清晰而又分散較好的5 ～ 12個細(xì)胞供核型分析；（3）編號并進(jìn)行測量，隨體（sat）長度不計算在總長度內(nèi)；（4）根據(jù)測量所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行同源染色體配對，并計算其平均值，按染色體的總長度從長至短順序編號后取5 ～ 12個細(xì)胞的平均值，作為該物種的染色體參數(shù)；（5）染色體長度參數(shù)，按國際慣例，均示相對長度（RL）。

1.2.2 核型分析 按照Levan等[21]和李懋學(xué)等[22]的報道，以及Stebbins[23]的核型分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。根據(jù)染色體臂比來確定著絲粒的位置，得出核型公式（表1）；按核型中最長染色體與最短染色體之比及臂比大于2的染色體所占的比例來確定核型類型；按照Arano[24]的方法計算核型不對稱系數(shù)，其比值越大表示核型越不對稱。

2 結(jié)果與分析

2.1 芬芳安息香核型分析

表1 染色體臂比對應(yīng)的類型和形態(tài)特征Table 1 Arm ratio and their karyogram

從表2，表3，圖1至圖3可知，芬芳安息香的根尖細(xì)胞在有絲分裂中前期有8對計16條染色體，根尖體細(xì)胞染色體數(shù)2n = 2x = 16，表明為二倍體，染色體基數(shù)x=8；體細(xì)胞染色體核型公式：2n = 16 = 10 m+6 sm（2 sat），其中第1，2，5對染色體為sm，其余為m，第1和第5對染色體的短臂上各帶有1對sat。染色體相對長度范圍為9.75 ～ 23.41，AAR 1.61，L/S大于2的染色體有2對，比率為25%，Lt/St染色體的比值為2.40，ASI為58.20%，染色體IRL公式為1L+2M2+3M1+2S，核型為2A型。3種安息香屬植物染色體參數(shù)和核型特征見表2和表3；中期染色體、核型圖及核型模式圖見圖1至圖3。

表2 3種安息香屬植物的染色體組型分析Table 2 Karyotype analysis of 3 species of Styrax

表3 3種安息香屬植物核型參數(shù)Table 3 Karyotype parameters of 3 species of Styrax

圖 1 3種安息香屬植物根尖細(xì)胞有絲分裂中前期染色體圖Figure 1 Metaphase chromosome of root tip cells from 3 species of Styrax

圖 2 3種安息香屬植物核型模式圖Figure 2 Idiogram of 3 species of Styrax

2.2 越南安息香核型分析

從表2，表3，圖1至圖3可知，越南安息香的根尖細(xì)胞在有絲分裂中前期有8對計16條染色體，根尖體細(xì)胞染色體數(shù) 2n = 2x = 16，表明為二倍體，染色體基數(shù)x=8；體細(xì)胞染色體核型 公式為2n = 16 = 12 m（1sat）+4 sm （2 sat），其中第1和第2對染色體為sm，其余為m，第1，第2，第3對染色體的短臂上各帶有1對sat，L/S最高為1.91。染色體相對長度范圍為10.03 ～ 20.33，AAR 1.42，沒有臂比大于2的染色體，Ls/St 為2.01，ASI為53.27%，染色體IRL組成為1L+2M2+4M1+1S，核型為1A 型。

2.3 賽山梅核型分析

從表2，表3，圖1至圖3可知，賽山梅的根尖細(xì)胞在有絲分裂中前期有8對計16條染色體，根尖體細(xì)胞染色體數(shù)2n = 2x = 16，表明為二倍體，染色體基數(shù)x = 8；體細(xì)胞染色體核型公式為2n = 16 =12 m（1 sat）+4 sm。賽山梅第1和第7對染色體為sm，其余為m，第3對染色體的短臂上各帶有1對sat，L/S最高為1.90。染色體相對長度范圍為10.04 ～ 14.69，AAR 1.46，沒有臂比大于2的染色體，Ls/St為1.76，ASI為56.54%，染色體IRL組成為1L+2M2+5M1，核型為1A型。

3 結(jié)論與討論

圖 3 3種安息香屬植物染色體核型圖Figure 3 Chromosome karyotype of 3 species of Styrax

研究觀察到的3種安息香屬植物均為二倍體，且體細(xì)胞染色體數(shù)均為2n = 2x = 16，染色體多數(shù)為m，少數(shù)為sm，沒有st和t。

根據(jù)物種進(jìn)化的趨勢，從染色體數(shù)目看，在多倍體植物中，一般是從2倍體向多倍體演化，從染色體核型看，是從對稱性向非對稱性演化。Stebbins按對稱性程度的高低將染色體核型分為12種類型（1A，2A，3A，4A；1B，2B，3B，4B；1C，2C，3C，4C），認(rèn)為核型對稱性程度越高的生物，其染色體變異越小，進(jìn)化程度也越低，對稱性程度越低的生物，其染色體變異越大，進(jìn)化程度越高[23]。根據(jù)染色體核型圖（圖3）和組成公式（表3）可以看出越南安息香與賽山梅核型相近，均為1A型，前者比后者多了兩對隨體，而與芬芳安息香核型（2A型）差異較大，說明越南安息香與賽山梅親緣關(guān)系較近，而與芬芳安息香親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，芬芳安息香比越南安息香和賽山梅的進(jìn)化程度要高。但三個種的核型均為A型，表明其進(jìn)化程度總體上都較低。

安息香屬植物染色體數(shù)目已知的有n=8和n=20（野茉莉 Styrax japonicus），但本研究中亦發(fā)現(xiàn)有極少的n=16的現(xiàn)象（結(jié)果未在本論文中列出），出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是細(xì)胞在有絲分裂時出錯造成。從現(xiàn)有資料看，多數(shù)安息香屬植物體細(xì)胞染色體數(shù)都為2n = 2x =16，但核型差異明顯，這些差異可能造就了安息香屬植物的遺傳多樣性。

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Karyotype Analysis of Root Chromosome in Three Species of Styrax

SHI Cong-guang1，GAO Yan-hui2，LIU Xin-hong1，LI Yin-gang1，YANG Shao-zong1，JIANG Dong-yue1，ZHU Guang-quan1

（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China)

Seeds of Styrax odoratissimus, S. tonkinensis and S. confusus were collected on September and October of 2013 in Hangzhou, Zhejiang province. They were treated by sand storage until the next spring. When seeds germinated and root had 3-5 cm, the apices of three species were used for chromosome sectioning and karyotype analysis. The results showed that the tested species were diploid, and their genome chromosome number was 2n=2x=16. Karyogram of S. o doratissimus was 2n=16=10 m+6 sm (sat), n uclear as ymmetry i ndex was 58.20%, and karyotype was 2A. Karyogram of S. tonkinensis was 2n=16=12m(1sat)+4sm(2sat), nuclear asymmetry index was 53.09%, andt karyotype was 1A. Karyogram of S. confusus was 2n=16=12 m(1sat)1+4 sm, nuclear asymmetry index was 56.54%, and the karyotype was 1A. The test concluded that karyotypes of S. tonkinensis and S. confusus were similar, but different with that of S. odoratissimus, indicating that the chromosome evolution of three species was low, and they were primitive.

Styrax; chromosome; karyotype analysis; diploid; evolution

S722.3

：A

：1001-3776（2017）03-0023-05

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.03.004

2016-11-16；

2017-02-21

本稿件受浙江省農(nóng)業(yè)公益性研究項目“安息香屬優(yōu)質(zhì)能源樹種選擇與開發(fā)利用”資助（2012C22097）

石從廣，博士，副研究員，從事林木遺傳改良研究；E-mai：363928874@qq.com。通信作者：朱光權(quán)，教授級高工，從事植物分類學(xué)研究；E-mail：2554396001@qq.com。