辛燕花，張鐵丹，楊龍龍，徐瀾，梁彬，孟悅

(1.忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000； 2.廣州萬(wàn)物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642)

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外源茉莉酸甲酯對(duì)靈芝多糖及靈芝酸含量的影響

辛燕花1,2，張鐵丹2，楊龍龍1，徐瀾1，梁彬1，孟悅1

(1.忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000； 2.廣州萬(wàn)物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642)

[目的]探尋外源茉莉酸甲酯對(duì)靈芝多糖及靈芝酸含量的影響。[方法]用含有不同濃度的茉莉酸甲酯在不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)液體培養(yǎng)基中的靈芝進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。[結(jié)果]在發(fā)酵培養(yǎng)的第4天，添加外源茉莉酸甲酯濃度為50 μmol·L-1時(shí)，靈芝菌絲體和菌液中靈芝多糖含量最高，菌絲體中靈芝多糖含量為398.98 mg·g-1，是對(duì)照的1.83倍；菌液中的靈芝多糖含量為4.20 g·L-1，是對(duì)照的1.56倍。添加外源茉莉酸甲酯濃度為100μmol·L-1時(shí)，靈芝菌絲體及菌液中靈芝酸含量最多，靈芝菌絲體中靈芝酸為50.02 mg·g-1，是對(duì)照的1.93倍；菌液中靈芝酸含量為7.10 mg·L-1，是對(duì)照的2.21倍。[結(jié)論]說明外源茉莉酸甲酯能夠有效的促進(jìn)靈芝多糖和靈芝酸的合成。

靈芝； 茉莉酸甲酯； 多糖； 靈芝酸

靈芝(Ganodermalucidum)又稱靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草[1]，在分類系統(tǒng)上是隸屬于真菌門(Eumycota)，擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層擔(dān)子菌綱(Hymenomycetes)，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，靈芝菌科(Ganodermataceae)，靈芝屬(Ganoderma)[2]。靈芝在我國(guó)已有久遠(yuǎn)的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，醫(yī)書上一直將其列為上品，稱其含有補(bǔ)中益氣、滋陰強(qiáng)壯、扶正固本、延年益壽等功效。靈芝是《中國(guó)藥典》收錄的一種中藥材，是食藥同源的一種真菌，靈芝中的多糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中三萜化合物和多糖是靈芝最主要的兩大活性成分。靈芝酸是一種三萜類物質(zhì)，目前分離得到100種左右，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)靈芝酸有保肝、抗腫瘤、抗 HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化等作用[3～6]。靈芝多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老以及調(diào)節(jié)血糖等生理功能[7～10]。

研究表明，茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)作為一種信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)許多植物的生理反應(yīng)[11，12]，在植物中，茉莉酸甲酯可以誘導(dǎo)單萜類生物堿和類異戊二烯的生物合成，通過激活活性氧或者依賴于鈣離子的蛋白激酶等手段進(jìn)行防御反應(yīng)等[13～16]，在真菌中，茉莉酸甲酯參與調(diào)節(jié)隱球菌和青霉菌的生長(zhǎng)[16]，并且有研究者發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯可以調(diào)控大型真菌靈芝中的三萜類合成代謝途徑[17]。本試驗(yàn)在不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)靈芝液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的茉莉酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，探討外源茉莉酸甲酯對(duì)靈芝多糖及靈芝酸含量的影響，為靈芝多糖和靈芝酸的提取提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

靈芝購(gòu)于福建省農(nóng)科院研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基和菌株生長(zhǎng)條件

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，磷酸氫二鉀3 g，硫酸鎂2.0 g，葡萄糖20 g，25 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)7 d。

1.1.3 主要試劑和儀器

茉莉酸甲酯購(gòu)于Sigma公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。所用儀器：TYAIB 0.24/10高壓蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F 凈化工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752 N紫外可見光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

以乙醇為助劑(2 mL·L-1)，在不同發(fā)酵時(shí)間(3，4，5，6 d)的培養(yǎng)基中分別加入茉莉酸甲酯,使茉莉酸甲酯的終濃度分別為0、20、50、100、150、200 μmol·L-1，在25 ℃恒溫室內(nèi)的搖床上以180 r·min-1轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩發(fā)酵培養(yǎng)7 d，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌液和菌絲體，菌絲體放入電熱鼓風(fēng)干燥箱40 ℃烘干，研成粉末后，待測(cè)。

對(duì)靈芝菌絲體及發(fā)酵液中靈芝多糖和靈芝酸進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 靈芝多糖的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖含量，參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以0.1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)在489 nm處，測(cè)吸光度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=6.121 4C+0.007 7，R2=0.999 4。

1.2.2.2 靈芝多糖提取

靈芝多糖提取參照文獻(xiàn)進(jìn)行[18]，稍作改動(dòng)：菌液中多糖的測(cè)定：取5.00 mL 菌液，加 15 mL 無(wú)水乙醇，混勻，靜置12 h 后4 000 r·min-1離心10 min，棄上清，在室溫下晾干沉淀，獲得胞外粗多糖；然后加20.00 mL 雙蒸水進(jìn)行溶解后，對(duì)溶液進(jìn)行脫色和脫蛋白處理后，測(cè)量吸光度，計(jì)算含量。 菌絲體中多糖的測(cè)定：精確稱量烘干后的菌絲體0.100 0 g于50 mL離心管中，加入10.00 mL雙蒸水，在微波爐中用中火(P50，1.3 kw)微波3 min后， 4 000 r·min-1離心10 min，取上清液5.00 mL于試管中，加15 mL 無(wú)水乙醇，靜置12 h沉淀多糖，離心，棄上清，在室溫下晾干沉淀，得到胞內(nèi)粗多糖；在沉淀中加 10.00 mL 雙蒸水進(jìn)行溶解后，對(duì)溶液進(jìn)行脫色和脫蛋白處理，測(cè)量吸光度，計(jì)算含量。

1.2.3 靈芝酸測(cè)定

以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸和高氯酸法測(cè)定靈芝總?cè)坪縖18]。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

制作熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]，在 548 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=3.446 4C+0.003，R2=0.999 4。

1.2.3.2 靈芝酸測(cè)定

靈芝酸測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[18]，稍作改動(dòng)。菌液中靈芝酸的測(cè)定：吸取培養(yǎng)液2.00 mL，60 ℃水浴15 min 后，在冰水浴中加入5.00 mL冰醋酸立即搖勻，室溫靜置 15 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。菌絲體中靈芝酸的測(cè)定：精密稱取烘干后的菌絲體0.1 000 g于50 mL離心管，加入10.00 mL 95%乙醇，放入微波爐用中低火(P30)微波1.5 min，離心 (4 000 r·min-1，10 min)，取上清液，向沉淀中加入 10.00 mL 95%乙醇，同上處理后，合并2 次提取液，取1 mL 提取液，步驟同上，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖含量的分析

2.1.1 靈芝菌絲體中多糖含量分析

從圖1中可以看出，靈芝菌絲體中多糖的含量與發(fā)酵時(shí)間和茉莉酸甲酯的濃度有關(guān)。在一定的發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度的茉莉酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌絲體中多糖的含量基本上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，茉莉酸甲酯的濃度為20、50、100 μmol·L-1時(shí)可以促進(jìn)菌絲體中多糖含量的積累，而添加高濃度的茉莉酸甲酯濃度150、200 μmol·L-1時(shí)，菌絲體中多糖的含量有所的降低。值得注意的是，在不同的發(fā)酵時(shí)間，茉莉酸甲酯的濃度為50 μmol·L-1時(shí)，多糖的積累都達(dá)到最大值。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度茉莉酸甲酯對(duì)靈芝菌絲體中多糖含量的影響Fig.1 Effects of fermentation time and concentration of methyl jasmonate on Ganoderma lucidum mycelia polysaccharide 注：a: 發(fā)酵第3天；b:發(fā)酵第4天；c:發(fā)酵第5天；d:發(fā)酵第6天。圖2～圖4同Note: a: Fermentation on the third day; b: Fermentation on the fourth day; c: Fermentation on the fifth day; d: Fermentation on the sixth day. The same as in Fig.2～Fig.4

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度茉莉酸甲酯對(duì)靈芝發(fā)酵液中多糖含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time and concentration of methyl jasmonate on Ganoderma lucidum broth polysaccharide

在發(fā)酵第3天、第4天、第5天、第6天添加茉莉酸甲酯濃度為50 μmol·L-1時(shí)，菌絲體中多糖含量分別是空白組含量的1.98、2.75、1.60、1.5倍。在酵液培養(yǎng)的第4天，添加外源莉酸甲酯的濃度為50 μmol·L-1時(shí)，靈芝菌絲體中多糖含量達(dá)到最大值，為398.98 mg·g-1。

2.1.2 發(fā)酵液中靈芝多糖含量分析

從圖2中可以看出，靈芝發(fā)酵液中多糖的含量受到發(fā)酵時(shí)間和茉莉酸甲酯的濃度影響。在一定的發(fā)酵時(shí)間添加濃度不同的茉莉酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，發(fā)酵液中多糖的含量基本上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。在不同的發(fā)酵時(shí)間，茉莉酸甲酯的濃度為50 μmol·L-1時(shí)，多糖的積累都達(dá)到最大值。

在發(fā)酵第3天、第4天、第5天、第6天添加茉莉酸甲酯濃度為50 μmol·L-1時(shí)，發(fā)酵液中多糖含量分別是空白組含量的1.42、2.00、1.62、1.48倍。發(fā)在酵液培養(yǎng)的第4天，添加外源莉酸甲酯的濃度為50 μmol·L-1時(shí)，靈芝發(fā)酵液中多糖含量達(dá)到最大值，為4.25 g·L-1。

2.2 靈芝酸含量的分析

2.2.1 靈芝菌絲體中靈芝酸的含量分析

從圖3中可以看出，靈芝菌絲體中靈芝酸的含量隨著不同的發(fā)酵時(shí)間和添加外源茉莉酸甲酯濃度的不同而變化。在一定的發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度的茉莉酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌絲體中靈芝酸的含量基本上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在不同的發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)的靈芝，低濃度的茉莉酸甲酯對(duì)靈芝酸的積累有促進(jìn)的作用，高濃度的茉莉酸甲酯則有抑制的作用。當(dāng)添加外源茉莉酸甲酯的濃度為100 μmol·L-1時(shí)，對(duì)靈芝菌絲體中靈芝酸的含量影響最顯著。在發(fā)酵第3天、第4天、第5天、第6天添加茉莉酸甲酯濃度為100 μmol·L-1時(shí)，靈芝酸的含量分別是空白組含量的1.79、4.00、1.89、1.65倍。發(fā)在酵液培養(yǎng)的第4天，添加外源莉酸甲酯的濃

度為100 μmol·L-1時(shí)，靈芝菌絲體中靈芝酸含量積累到最大值為50.02 mg·g-1。

2.2.2 靈芝發(fā)酵液中靈芝酸的含量分析

由圖4可以看出，靈芝發(fā)酵液中靈芝酸的含量隨著不同的發(fā)酵時(shí)間和添加不同濃度的外源茉莉酸甲酯而變化。在相同的發(fā)酵時(shí)間添加濃度不同的茉莉酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，發(fā)酵液中靈芝酸的含量基本上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，添加不同濃度的外源茉莉酸甲酯都能促進(jìn)靈芝發(fā)酵液中靈芝酸的積累。在不同的發(fā)酵時(shí)間，添加外源茉莉酸甲酯的濃度為100 μmol·L-1時(shí)，對(duì)靈芝發(fā)酵液中靈芝酸的含量影響最顯著，添加外源茉莉酸甲酯濃度為100 μmol·L-1時(shí)，在發(fā)酵第3天、第4天、第5天、第6天發(fā)酵液中多糖含量分別是空白組含量的2.13、2.22、2.03、2.05倍。發(fā)在酵液培養(yǎng)的第4天，添加外源莉酸甲酯的濃度為100 μmol·L-1時(shí)，靈芝發(fā)酵液中靈芝酸含量積累到最大值，為7.10 mg·L-1。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度茉莉酸甲酯對(duì)靈芝菌絲體中靈芝酸含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time and concentration of methyl jasmonate on Ganoderma lucidum mycelia ganoderic acid

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間添加不同濃度茉莉酸甲酯對(duì)靈芝發(fā)酵液中靈芝酸含量的影響Fig.4 Effects of fermentation time and concentration of methyl jasmonate on Ganoderma lucidum broth ganoderic acid

3 討論與結(jié)論

靈芝多糖和靈芝酸由于突出的藥用價(jià)值引發(fā)人們的極大關(guān)注。靈芝多糖和靈芝酸都是靈芝在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物積累是一個(gè)重要的感應(yīng)應(yīng)急過程，取決于茉莉酸甲酯對(duì)多個(gè)基因的調(diào)節(jié)反應(yīng)[19]。大量研究表明，不同時(shí)期的細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)子的反應(yīng)靈敏度不同，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生長(zhǎng)周期才可以有效的接受誘導(dǎo)信號(hào)，此時(shí)，誘導(dǎo)子表現(xiàn)出最強(qiáng)的誘導(dǎo)活性。李陽(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)，在高山紅景天愈傷組織培養(yǎng)20天后加入一定濃度的茉莉酸甲酯后，高山紅景天中的多糖積累達(dá)到最大[20]。在本研究中，添加茉莉酸后靈芝多糖和靈芝酸的積累都是在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第4天積累達(dá)到最大值，對(duì)其生長(zhǎng)曲線的觀察，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的第4天，靈芝菌株正處于穩(wěn)定期，當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定期的時(shí)候，初級(jí)代謝基本完成，開始生產(chǎn)有用的次級(jí)代謝產(chǎn)物[21]。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)的第4天添加適當(dāng)濃度的茉莉酸甲酯，靈芝多糖和靈芝酸的含量都達(dá)到了最大值。這個(gè)結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報(bào)道類似，當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定期的時(shí)候，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的次生代謝物的積累達(dá)到最大值[22～24]。

外源茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)效應(yīng)除了與細(xì)胞的生長(zhǎng)周期有關(guān)外，還與茉莉酸甲酯的濃度有一定的關(guān)系。有研究者發(fā)現(xiàn)低濃度的茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)葡萄懸浮細(xì)胞中酚性成分含量的增加[25]，促進(jìn)紅豆杉懸浮細(xì)胞中紫杉醇的積累[26]，使長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)不定根中吲哚生物堿的含量增加[27]，促進(jìn)三七組苗中總皂苷的含量[28]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)低濃度的茉莉酸甲酯可以有效促進(jìn)靈芝中多糖和靈芝酸的積累，高濃度的茉莉酸甲酯有抑制的作用。外源茉莉酸的誘導(dǎo)促進(jìn)靈芝次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和積累的機(jī)制，因次生代謝物類型的不同而不同，在本研究中，多糖的積累達(dá)到最大值時(shí)所需茉莉酸甲酯的濃度要低于靈芝酸所需要的濃度。高濃度的茉莉酸甲酯對(duì)靈芝中多糖和靈芝酸積累起到抑制的原因是否是因?yàn)楦邼舛鹊能岳蛩峒柞?duì)靈芝產(chǎn)生了較強(qiáng)的氧化損傷，還是抑制了這些次級(jí)代謝物的關(guān)鍵酶的表達(dá)，還需要進(jìn)一步的探究。

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(編輯：馬榮博)

Effect of exogenous methyl jasmonate on contents of polysaccharide and acid ofganodermalucidum

Xin Yanhua1,2, Zhang Tiedan2, Yang Longlong1, Xu Lan1, Liang Bin1, Meng Yue1

(1.XinzhouTeachersUniversity，Xinzhou034000,China; 2.Guangzhoucreationhealthindustrylimitedcompany,Guangzhou510642,China)

[Objective]The study aimed to determine the effect of adding exogenous methyl jasmonate on contents of polysaccharide and acid ofganodermalucidumin liquid culture.[Methods]The contents of polysaccharide and acid ofG.lucidumin culture medium and mycelium were determined by adding different concentrations of exogenous methyl jasmonate on different fermentation days.[Results]TheG.lucidumpolysaccharide contents were the highest in culture solution adding 50 μmol·L-1on the fourth day, with 398.98 mg·g-1in mycelium, and 7.57 g·L-1in its culture medium, which were 2.82 and 6.56 times over that of blank control; TheG.lucidumacid content was the highest in culture solution adding 100 μmol·L-1on the fourth day, with 50.02 mg·g-1in mycelium, and 7.10 mg·L-1in its culture medium, which were 1.93 and 2.21 times over that of blank control.[Conclusion]The contents of polysaccharide and acid ofG.lucidumcould be significantly increased by appropriately adding exogenous methyl jasmonate on the appropriate fermentation day.

Ganodermalucidum, Methyl jasmonate, Polysaccharides, Triterpenoid

2016-11-17

2017-05-26

辛燕花(1986-)，女(漢)，山西忻州人，講師，博士研究生，研究方向：天然活性產(chǎn)物研發(fā)和分子代謝調(diào)控機(jī)理

Q93

A

1671-8151(2017)09-0656-07