路 希，李 俐，王慧娟，林 冰，周 英*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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鐵皮石斛破壁飲片中多糖含量測(cè)定

路 希1，2，3，李 俐1，王慧娟2，3，林 冰2，3，周 英2，3*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

建立鐵皮石斛破壁飲片中多糖含量的測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。用水提醇沉法提取鐵皮石斛破壁飲片中的多糖，采用苯酚—硫酸法對(duì)12批次鐵皮石斛中的多糖進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明：該測(cè)定方法經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察后 RSD < 3%，加樣回收率為100.94%，試驗(yàn)穩(wěn)定可靠，可用于鐵皮石斛破壁飲片中多糖含量的測(cè)定。

鐵皮石斛；破壁飲片；多糖；含量測(cè)定

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)為蘭科(Orchidaceac)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物。在我國(guó)主要分布于云南、廣西、海南、貴州、臺(tái)灣等地。具有益胃生津，滋陰清熱的作用，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟[1]。

破壁飲片是采用現(xiàn)代超微技術(shù)，將中藥飲片粉碎至300目、粒徑小于45 μm，可供直接口服使用的新型中藥飲片。中藥破壁飲片具有高效免煎、攜帶方便、質(zhì)量可控、安全衛(wèi)生等特點(diǎn)，因此成為近年中藥研究的熱點(diǎn)。多糖在鐵皮石斛中的含量較高，是其主要活性成分，具有良好的抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫力[2-7]等作用。為了有效控制鐵皮石斛破壁飲片的質(zhì)量，本試驗(yàn)結(jié)合中國(guó)藥典對(duì)鐵皮石斛中多糖的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，旨在為鐵皮石斛破壁飲片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 12批鐵皮石斛微粉(由貴州涵龍生物科技有限公司提供)。

1.1.2 儀器與試劑Evolution201紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(ThermoScientific)；FA1104電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；Neofuge23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

無(wú)水葡萄糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110833-201506，含量99.9%)；葡聚糖(上海甑準(zhǔn)生物科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為9004-54-0)；無(wú)水乙醇(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)；濃硫酸(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)；苯酚(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部鐵皮石斛中多糖含量測(cè)定項(xiàng)下方法，制備供試品溶液[1]。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品23.6 mg，精密稱定，置于250 mL的容量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，分別精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制)，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，在400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。從圖1、圖2可知，對(duì)照品和供試品顯色后在488 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇488 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 葡萄糖對(duì)照品溶液紫外吸收光譜

圖2 鐵皮石斛供試品溶液紫外吸收光譜

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系考察 對(duì)照品溶液的制備，取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含94.4 μg的溶液，即得；標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部鐵皮石斛中多糖含量測(cè)定項(xiàng)下方法，制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]。1.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至1.0 mL；按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從“精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(樣品編號(hào)為10批)，按1.2項(xiàng)供試液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從“取供試品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.2.4.3”項(xiàng)下重復(fù)性試驗(yàn)中的第一份供試液，按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從“取供試品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，在488 nm波長(zhǎng)處每隔10 min測(cè)一次吸光度，并計(jì)算RSD值。

1.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取葡聚糖約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。量取葡聚糖供試品溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，顯色后在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算葡聚糖中多糖的含量。平行稱取6份第10批鐵皮石斛微粉，每份約0.15 g，分別加入葡聚糖約50 mg(多糖含量為874.16 mg/g)，按照1.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備的方法，制備葡聚糖供試液，取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中的供試品溶液的制備方法得到溶液，按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從“取供試品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率以及RSD值。

計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系與方法學(xué)考察結(jié)果2.1.1 線性關(guān)系 以葡萄糖對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。得到回歸方程y=0.073 1x+0.003 8(R2=0.998)，葡萄糖在2.70～13.49 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖3 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至1.0 mL。按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，在488 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1。吸光度RSD為0.73%。表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(樣品編號(hào)為10批)，按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備，平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到RSD為0.91%(如表2)，表現(xiàn)該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.2.4.3”項(xiàng)下重復(fù)性試驗(yàn)中的第一份供試液，按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備，從“取供試品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，在488 nm波長(zhǎng)處每隔10 min測(cè)一次吸光度，計(jì)算得到RSD為1.36%。說(shuō)明該測(cè)定方法于200 min內(nèi)穩(wěn)定。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) “1.2.4.5”項(xiàng)下測(cè)定的葡聚糖中多糖含量見(jiàn)表4。

表4 葡聚糖的含量測(cè)定

表5 多糖測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

平行稱取6份第10批鐵皮石斛微粉，每份約0.15 g，分別加入葡聚糖約50 mg(多糖含量為874.16 mg/g)，按照1.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備的方法，制備葡聚糖供試液，取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中的供試品溶液的制備方法得到溶液，按“1.2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從“取供試品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”開(kāi)始測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為0.97%，平均回收率為100.94%(如表5)。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表6 12批樣品中多糖測(cè)定結(jié)果

2.2 鐵皮石斛破壁飲片中多糖含量測(cè)定

取12批鐵皮石斛飲片(破壁)樣品，分別按“1.2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，顯色后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，12批次的鐵皮石斛破壁飲片的多糖含量介于26.25%～31.60%之間，發(fā)現(xiàn)多糖含量均大于藥典中關(guān)于鐵皮石斛原藥材規(guī)定的(25%)，但是12批次之間有較大的差異，這可能與種植的環(huán)境以及采收的年限有關(guān)。每一批次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中RSD<3%，表明該實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論與討論

本研究采用水提醇沉法提取鐵皮石斛破壁飲片中多糖，采用苯酚—硫酸法對(duì)12批次鐵皮石斛中的多糖進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明該試驗(yàn)穩(wěn)定可靠。在多糖測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，多以單糖(葡萄糖)做為對(duì)照品，且葡萄糖的加入是在水提醇沉之后。由于葡萄糖沒(méi)有參與前期的水提醇沉過(guò)程，常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高(加樣回收率達(dá)為106.55%)[8-10]。葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖，本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖為對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，且將葡聚糖加入的時(shí)間設(shè)置在水提醇沉之前。結(jié)果顯示，與用葡萄糖為對(duì)照品的方法相比較，減少了實(shí)驗(yàn)誤差(加樣回收率達(dá)為100.94%)，表明該方法可用于鐵皮石斛破壁飲片中多糖的含量測(cè)定，但這方法是否適用于其它多糖含量的測(cè)定尚需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Study on the Content Determination Method of Dendrobium Officinale Wall-broken Decoction Pieces Polysaccharide

LUXi1，2，3，LILi1，WANGHui-juan2，3，LINBing2，3，ZHOUYing2，3*

(1.CollegeofPharmacy，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025China；2.GuizhouTraditionalChineseMedicineandEthnicdrugEngineeringCenter，Guiyang，Guizhou550025China；3.GuizhouMedicineEdiblePlantResourcesResearchandDevelopmentCenter，Guiyang，Guizhou550025China)

A method for determination of polysaccharides in wall-broken decoction pieces ofDendrobiumofficinalewas established and it was proved by methodological validation. Polysaccharide in 12 batches ofD.officinalewas extracted by water-extraction and alcohol-precipitation method，and then determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the RSD<3% and the recovery rate were 100.94% after investigation of precision，stability and repeatability.The assay was stable and reliable，and could be used for the determination of polysaccharides in wall-broken decoction pieces ofD.officinale.

dendrobiumofficinale；cell wall-broken decoction pieces；polysaccharide；content determination

2016-11-17；

2017-03-20

貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心(黔科合G字[2015]4001號(hào))；貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室(黔發(fā)改投資[2015]542號(hào))；施秉中藥材產(chǎn)業(yè)科技合作專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目合同書(shū)(施中藥科合專項(xiàng)(2013)號(hào))。

R927.2

A

1008-0457(2017)03-0091-04 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.03.017

*通訊作者：周英(1971-)，女，博士，教授，主要研究方向：藥物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)的研究；E-mail：yingzhou71@126.com。