蘭頤　楊琳　史大勇　王英新　吳學萍　謝璇　吳清

[摘要]該文擬采用經(jīng)皮微透析技術測定花椒揮發(fā)油對不同脂溶性中藥成分皮膚藥動學行為的影響，評價其在體經(jīng)皮促透特征。選擇川芎嗪和葛根素作為親脂性和親水性模型藥物，采用濃差法考察微透析探針體外回收率與傳遞率，采用反向滲析法測定藥物探針在體回收率；以常用化學促透劑氮酮為陽性對照，測定不同濃度花椒揮發(fā)油對川芎嗪和葛根素的皮膚藥動學行力影響。結果顯示，2種模型藥物探針回收率與傳遞率相等，藥物在滲析膜間無相互作用，川芎嗪和葛根素的在體相對回收率分別為5917%，1985%。在體經(jīng)皮試驗表明花椒揮發(fā)油對川芎嗪具良好促透效果，且呈濃度依賴性關系，5%花椒揮發(fā)油的在體促透倍數(shù)（ER）為9864，比氮酮最佳濃度的促透效果更好（3%氮酮，ER=8911）；同時，花椒揮發(fā)油也可顯著增加葛根素的在體經(jīng)皮吸收，也表現(xiàn)出濃度依賴性關系。因此，該研究進一步證實花椒揮發(fā)油作為經(jīng)皮促透劑的良好促透性能，為其在中藥外用制劑中的應用提供了數(shù)據(jù)支持。

[關鍵詞]花椒揮發(fā)油； 微透析； 促透劑； 在體經(jīng)皮吸收； 反向滲析法

[Abstract]The aim of this paper is to investigate the topical pharmacodynamics behavior of different lipophilic model drugs after treatment with essential oil from Zanthoxyli Pericarpium by using the cutaneous microdialysis technique， and then evaluate its in vivo transdermal penetration enhancing properties Two traditional Chinese medicine active components， namely tetramethylpyrazine and puerarin， were chosen as lipophilic and hydrophilic model drugs， respectively Firstly， the concentration difference method was employed to measure the in vitro recovery rate and loss of the microdialysis probe， and the in vivo recoveries of two model drugs were determined by using the retrodialysis method Secondly， the skin pharmacodynamics behaviors of two model drugs were studied after treatment with different concentrations of the essential oil， and the wellestablished and standard penetration enhancer Azone was selected as a positive control It was found that the recovery of microdialysis probe was equal to its loss for two model drugs， with no interaction between drugs in dialysis membranes The retrodialysis studies revealed that the in vivo recovery of tetramethylpyrazine and puerarin were 5917%， 1985%， respectively The skin pharmacodynamics studies showed that the essential oil could facilitate the transdermal absorption of tetramethylpyrazine in a concentrationdependent manner， and the enhancement ratio （ER） for 5% essential oil was 9864， which was higher than that of the optimum concentration of Azone （3% Azone， ER=8911） Meanwhile， the Zanthoxyli Pericarpium could effectively promote the transdermal permeation of the puerarin in a concentrationdependent manner Hence， this study further confirmed that the Zanthoxyli Pericarpium had excellent penetrationenhancing activity as a natural transdermal penetration enhancer， providing data support for its application in traditional Chinese medicine external preparations

[Key words]essential oil from Zanthoxyli Pericarpium； microdialysis； penetration enhancer； in vivo transdermal absorption； retrodialysis method

花椒為蕓香科植物花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim或青椒Z schiniflium Sieb et Zucc的干燥成熟果皮，性溫味辛，在中藥外治方中多作引使藥，利用其“氣味俱厚”之性而“率領群藥，直達病所”[1]，類似現(xiàn)代經(jīng)皮促透劑。課題組前期研究也顯示[24]，花椒揮發(fā)油對不同極性中藥成分具良好經(jīng)皮促透效果，且皮膚刺激性小，具備開發(fā)成天然經(jīng)皮促透劑的潛力。但是，目前對花椒揮發(fā)油經(jīng)皮促透效果的評價主要采用離體動物皮膚進行研究，尚缺乏活體動物的在體研究，考慮到離體皮膚與活體皮膚間差異，如皮下血流微循環(huán)、酶等對藥物經(jīng)皮通透性的影響，單一的體外促透數(shù)據(jù)尚不能充分了解其經(jīng)皮促透效果[2]。

本文擬在前期體外經(jīng)皮促透研究基礎上[45]，分別選擇川芎嗪（油水分配系數(shù)，lgP=234）和葛根素（lgP=-035）作為親脂性和親水性模型藥物，采用經(jīng)皮微透析技術測定花椒揮發(fā)油對模型藥物經(jīng)皮藥動學的影響，研究其在體經(jīng)皮促透特征，進一步驗證花椒揮發(fā)油作為經(jīng)皮促透劑的促滲性能，為其在中藥外用制劑中的合理應用和天然經(jīng)皮促透劑開發(fā)提供研究依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料

微透析系統(tǒng)，包括Pump 11 Elite 型微量注射泵（HARVARD APPARATUS），25 mL 玻璃注射器（Hamilton），CMA 30 線性微透析探針（CMA，半透膜長度為1cm，截留相對分子質(zhì)量6 000）；島津高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC20 AT泵、SPD20A雙波長紫外檢測器和LC Solution色譜工作站；TK20B藥物透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；CP7800型電動遞毛器（科德士電器有限公司）。

花椒藥材購于北京本草方源藥業(yè)有限公司（批號20131007，產(chǎn)地遼寧），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥炮制系譚鵬副教授鑒定為蕓香科植物花椒Z bungeanum的干燥成熟果皮，采用水蒸汽蒸餾法提取花椒揮發(fā)油（收率約為29%），主要成分為4萜烯醇（1842%）、桉樹腦（1549%）、檸檬烯（747%）等[3]。川芎嗪（SigmaAldrich，批號14003DEV）；葛根素（NCE Biomedical，批號20131209，純度>9800%）；氮酮（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20110831）；烏來糖（國藥集團化學試劑有限公司，批號20140312）；乙腈（Fisher，色譜純）；其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠[5周齡，體質(zhì)量（200±10）g]，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，許可證號[SCXK（京）2011004]

2方法

21川芎嗪HPLC方法的建立

色譜條件：Merck Purospher STAR RP18e色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈水（40∶60），流速10 mL·min-1，檢測波長282 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，川芎嗪的相對保留時間約為56 min，理論榙板數(shù)川芎嗪峰計算就不低于5 000。

分別取川芎嗪微透析試驗灌注液（即PBS溶液，pH 72）、川芎嗪對照液和川芎嗪微透析試驗滲析液，考察色譜條件測定方法的專屬性，結果顯示滲析液中其他成分對川芎嗪的測定無干擾；稱取川芎嗪對照品適量，用微透析灌注液配制系列對照品溶液（01，1，5，10，20，50，100，200，400 mg·L-1）考察方法線性關系，川芎嗪在01～400 mg·L-1線性關系良好，回歸方程為y=31 97029x+55 41201 （R2=0999 5）；高、中、低3個質(zhì)量濃度（即200，20，1 mg·L-1）的日內(nèi)精密度分別為020%，012%，035%，日間精密度分別為27%，25%，24%；線性范圍內(nèi)高、中、低3個質(zhì)量濃度（即200，20，1 mg·L-1）的方法回收率分別為9761%，9580%，9559%，方法回收率良好。

22葛根素HPLC方法的建立

色譜條件：Grace Alltima HP C18 AQ色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈水（20∶80），流速10 mL·min-1，檢測波長251 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，葛根素的相對保留時間約為53 min，理論榙板數(shù)葛根素峰計算就不低于5 000。

分別取葛根素微透析試驗灌注液（即PBS溶液，pH 72）、葛根素對照液和葛根素微透析試驗滲析液，考察色譜條件測定方法的專屬性，結果顯示滲析液中其他成分對葛根素的測定無干擾；稱取葛根素對照品適量，用微透析灌注液配制系列對照品溶液（01，1，5，10，20，50，100，200，400 mg·L-1）考察方法線性關系，葛根素在01～400 mg·L-1線性關系良好，回歸方程為y=42 55792x+26 07854 （R2=1000）；高、中、低3個質(zhì)量濃度（即200，20，1 mg·L-1）的日內(nèi)精密度分別為026%，032%，048%，日間精密度分別為0050%，0070%，022%。線性范圍內(nèi)高、中、低3個質(zhì)量濃度（即200，20，1 mg·L-1）的方法回收率分別為9927%，9774%，9748%，方法回收率良好。

23濃差法測定模型藥物體外微透析回收率

配制含362 mg·L-1 川芎嗪或512 mg·L-1葛根素的等滲PBS緩沖液（pH=72）置于透皮池內(nèi)，溫度維持在37 ℃，攪拌子轉率設置為200 r·min-1。以一系列含不同濃度川芎嗪或葛根素的等滲PBS緩沖液進行灌注，灌注速率為10 μL·min-1，灌注液質(zhì)量濃度分別為0625，125，25，50，100，200 mg·L-1。每次更換灌注液至少開泵沖洗平衡約1 h才開始收集下一個樣品，每30 min收集1次樣品，重復收集3次，收集滲析液樣品按HPLC方法進行含量測定。

24反向滲析法測定模型藥物的探針在體回收率

241微透析探針植入皮下手術過程取SD大鼠，用02 g·mL-1烏來糖按體重（15 g·kg-1，ip）麻醉后，固定于鼠板上，遞毛器小心遞去腹部毛發(fā)；將經(jīng)皮微透析探針（半透膜長度為10 mm）用引導針穿刺植入大鼠皮下后（穿刺長度保持約30 mm），引導針小心抽回，微透析探針膜留于大鼠皮下組織中；在樣品收集前用等滲PBS緩沖液（pH 72）排除探針內(nèi)氣泡，并以流速10 μL·min-1灌注速率平衡1 h。

242探針體內(nèi)回收率及其穩(wěn)定性考察配制約為1 mg·L-1川芎嗪或葛根素的等滲PBS（pH 72）藥液，將線性微透析探針植入大鼠皮下組織后，以流速為10 μL·min-1灌注藥物溶液，每30 min收集滲析液1次，收集600 min，平行重復4次，然后選擇建立的HPLC分析方法測定川芎嗪或葛根素含量。

25在體經(jīng)皮微透析實驗

251經(jīng)皮微透析給藥手術取SD大鼠，用02 g·mL-1烏來糖按體重（15 g·kg-1，ip）麻醉后，固定于鼠板上，遞毛器小心遞去腹部毛發(fā)；將經(jīng)皮微透析探針（半透膜長度為10 mm）用引導針穿刺植入大鼠皮下后（穿刺長度保持約30 mm），引導針小心抽回，微透析探針膜留于大鼠皮下組織中，見圖1A；然后取體外透皮試驗中的供給池（內(nèi)徑15 mm，外徑25 mm），見圖1B，用UHU萬能膠小心均勻涂抹于供給池下口，將供給池貼于大鼠皮膚，并使導入皮下的探針半透膜區(qū)域正好位于供給池正中央；采用等滲PBS緩沖液（pH 72）以100 μL·min-1的灌注速率灌注10 min，排除微透析探針內(nèi)氣泡，然后切換為流速10 μL·min-1灌注速率平衡系統(tǒng)1 h。

252給藥方案根據(jù)前期體外透皮實驗給藥方案[45]，采用丙二醇與水的混合溶劑系統(tǒng)（PGH2O 80∶20），配制含20 g·L-1川芎嗪或葛根素的低中高濃度花椒揮發(fā)油（即1%，3%，5%），其中，只由溶劑系統(tǒng)配制的川芎嗪或葛根素溶液組作為對照組，并選擇常用經(jīng)典化學促透劑氮酮作為陽性對照。待微透析系統(tǒng)平衡完成后，加入2 mL不同組別的藥物溶液，并用封口膜將供給池上口封閉，防止溶液中水分揮發(fā)，每組重復4次。從加入藥物溶液后開始計時，每30 min收集滲析液樣品，共收集600 min，按22項進樣測定。

26數(shù)據(jù)處理與分析

相對回收率（R）是指藥物在滲析液中的濃度（Cd）和在組織液中的濃度（Cm）的比值，其一般性定義如下[6]。

R=Cd -CpCm -Cp （1）

其中，Cp為藥物在灌注液中的濃度。當藥物在灌注液中的藥物濃度大于探針周圍環(huán)境的濃度時，藥物則由灌注液進入組織液中，這種條件下所測得的回收率被稱為傳遞率（Loss），如果組織液中藥物的濃度相對灌注液中的濃度很低，則可認為Cm為零，傳遞率可由下式表示。

Loss=Cd-CPCP（2）

根據(jù)回收率的定義，用一系列含不同濃度藥物的灌注液進行微透析實驗，然后以Cd -Cm對Cp作圖，則得到一條直線，直線的斜率即為R，橫軸上的截距則為Cm；兩者可以由線性回歸方程分別計算出，這就是用于計算R和Cm的濃差法。但需要注意的是，只有當Cd-Cm>0時，藥物由探針周圍環(huán)境向灌注液擴散，此時R為回收率；當Cd-Cm<0時，灌注液中的藥物向周圍環(huán)境中擴散，這時所求得R為傳遞率[7]。

將各組滲析液樣品利用HPLC進行含量測定，按線性回歸方程求算其對應濃度值，根據(jù)每組探針對模型藥物的在體相對回收率，求算得皮膚組織下藥物真實濃度。根據(jù)每個時間點內(nèi)皮膚組織下的藥物濃度值和流經(jīng)探針的滲析體積（即30 μL），計算該時間點內(nèi)皮膚組織下的藥物質(zhì)量，并計算600 min內(nèi)藥物的累積透過量。

Q=ni=1CiVi（3）

其中，Q（μg）為累積透過量，Ci（mg·L-1）為第i個時間點的皮膚組織下藥物濃度，Vi為每個時間點的取樣體積（即為003 mL）。以藥物累積透過量對時間作圖，所得直線部分（480～600 min）的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Jss，μg·min-1），直線部分反向延長線與X軸的交點即為滯后時間（Tlag，min）[8]。

花椒揮發(fā)油的藥物促透比（enhancement ratio，ER）按下式計算。

ER=Jss（含促透劑）Jss （不含促透劑）

（4）

3結果

31川芎嗪和葛根素的體外微透析回收率

根據(jù)模型藥物體外微透析回收率的測定結果，以滲析液和灌注液中川芎嗪濃度差（即滲析液中藥物濃度的凈增加值）對灌注液中川芎嗪的濃度作圖，見圖2。圖2所示的直線為Cd-Cp=-0816 5Cp+1988 9 （R2=0999 9）。直線與橫軸交點處的濃度（244 mg·L-1）即為探針周圍濃度中川芎嗪的濃度，與透皮池中實際加入的藥物濃度（362 mg·L-1）相差不大，直線的斜率（即探針體外回收率）為（8165±502）%。

根據(jù)公式（1）分析，在Cd-Cp對Cp作圖中，橫軸以上直線部分的斜率為微透析探針回收率，而橫軸以下部分的斜率為傳遞率，由圖2，3可知，橫軸以下部分與橫軸以上部分斜率相等，說明該微透析探針的回收率與傳遞率對于川芎嗪和葛根素是相等的，表明在等滲PBS緩沖鹽溶液中，藥物在滲析膜間無相互作用，且經(jīng)過探針滲析膜正向與反向的擴散相等。

32川芎嗪和葛根素的探針體內(nèi)回收率及穩(wěn)定性

根據(jù)濃度法結果可知，川芎嗪和葛根素在微透析探針正向與反向擴散速率相等，表明可根據(jù)反向滲析法測定微透析探針對2種藥物的傳遞率，計算探針的藥物在體回收率，因此，按公式（2）所計算結果即為川芎嗪和葛根素的探針在體回收率，同時考察其在600 min內(nèi)探針在體回收率的穩(wěn)定性，結果見圖4。由圖4所知，川芎嗪的微透析探針在600 min內(nèi)的體回收率保持在（5917±122）%，葛根素的微透析探針在600 min內(nèi)的體回收率保持在（1985±160）%，表明兩者在600 min內(nèi)微透析探針的在體回收率穩(wěn)定。

33花椒揮發(fā)油對川芎嗪的在體促透吸收情況

花椒揮發(fā)油對川芎嗪透過大鼠皮膚的在體滲透藥時曲線見圖5，不同時間點對應藥物累積透過量見圖6，不同促透劑作用下川芎嗪在體透皮吸收參數(shù)見表1。由圖表可知，在氮酮作用下，不同濃度（低、中和高濃度）氮酮對川芎嗪的在體透皮吸收均具顯著促進作用。但是，3%氮酮對川芎嗪的促透倍數(shù)為8911，而5%氮酮對川芎嗪的促透倍數(shù)為5821，表明當?shù)黾拥揭欢舛群螅浯偻副稊?shù)有所降低，這與體外透皮試驗中氮酮的促透作用趨勢相同[4]；而花椒揮發(fā)油的在體促透倍數(shù)隨著揮發(fā)油濃度的增加而增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性關系，其中，當花椒揮發(fā)油應用濃度達到3%時，對川芎嗪的穩(wěn)態(tài)流速表現(xiàn)出顯著性差異；而當花椒揮發(fā)油的濃度達到5%時，其促透倍數(shù)為9864，較氮酮的促透效果更好（3% 氮酮，ER=8911）；同時，該研究結果顯示，花椒揮發(fā)油對川芎嗪在體透皮吸收的滯后時間有所延長，與化學促透劑氮酮相似。

34花椒揮發(fā)油對葛根素的在體促透吸收情況

花椒揮發(fā)油對葛根素透過大鼠皮膚的在體滲透藥時曲線見圖7，不同時間點對應藥物累積透過量見圖8，不同促透劑作用下葛根素在體透皮吸收參數(shù)見表2。由于采用HPLC未能有效的檢測出對照組葛根素的藥物含量，因此，不能有效反映出在應用促透劑后的促透倍數(shù)，這與葛根素親水性和較低的在體回收率有關。但從葛根素的經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)流速可知，在應用不同濃度氮酮后，其經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)流速明顯增加。同時，隨著氮酮應用濃度的進一步增加，其對葛根素的經(jīng)皮促透效果有所下降，這與課題組前期的體外透皮試驗結果一致[9]。而在花椒揮發(fā)油作用下，隨著揮發(fā)油濃度的不斷增加，對葛根素的經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)流速明顯增加，并表現(xiàn)出濃度依賴性關系。

4討論

經(jīng)皮微透析技術對藥物選擇性較高，并不適合于大量且較大極性范圍藥物的經(jīng)皮吸收實驗。因此，本研究根據(jù)前期體外透皮試驗系列不同極性模型藥物的選擇，選擇藥物極性相對適宜的偏親脂性藥物的川芎嗪和偏親水性藥物葛根素為代表，從而評價花椒揮發(fā)油的在體經(jīng)皮促透特征。

在經(jīng)皮微透析的體內(nèi)藥動學研究中，探針的相對回收率是求算皮膚組織中藥物含量的重要參數(shù)。該實驗考查灌注流速對探針回收率的影響，選擇了灌注流速為10 μL·min-1進行經(jīng)皮微透析實驗，既滿足了探針相對回收率要求，又保證有足量的滲析液樣品可用于藥物含量測定。同時，溫度、藥物的性質(zhì)、灌注液的組成也影響探針的回收率，本實驗的溫度值固定為37 ℃，灌注液也盡量接近皮下真實環(huán)境條件確定為等滲PBS緩沖溶液。

大量定量結構滲透性關系（quantitative structurepermeation relationship，QSPRs）研究顯示[910]，藥物的油水分配系數(shù)（lgP）是影響藥物皮膚通透性的主要理化參數(shù)，藥物的皮膚通透性與藥物的lgP值呈現(xiàn)拋物線關系，通常lgP在2～3的藥物經(jīng)皮滲透性較好，即具適宜親脂性藥物的經(jīng)皮透過性較好，親脂性過強或親水性藥物透皮吸收較差。本實驗中川芎嗪的適宜親脂性使其在未加促透劑條件下即有較好的透皮吸收，而葛根素為親水性藥物，藥物自身透皮吸收較差，加之微透析探針回收率也因其親水性而較低，因此，在未加入促透劑的正常條件下難以有效檢測其透皮吸收含量。但花椒揮發(fā)油的加入，葛根素的在體透過量增加明顯，這表明花椒揮發(fā)油對葛根素良好的經(jīng)皮促透效果。同時，與前期體外透皮試驗的經(jīng)皮促透相比[4]，在體與體外ER的相關性較好。

與化學促透劑氮酮相比，雖然低濃度的花椒揮發(fā)油對2種模型藥物在體經(jīng)皮促透倍數(shù)較低，但隨揮發(fā)油應用濃度的增加，對藥物的促透倍數(shù)增加明顯，而氮酮則隨濃度增加表現(xiàn)出先增加后逐漸降低的趨勢，這與花椒油和氮酮對皮膚結構作用機制有關，也與兩種促透劑的脂溶性有關，從而改變了藥物的熱力學活性[45]。

[參考文獻]

[1]吳尚先 理瀹駢文[M] 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2011：10

[2]鄭俊民 經(jīng)皮給藥新劑型[M] 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2006：45

[3]Rikke Holmgaard， Jesper B Nielsen， Eva Benfeldt Skin permeation assessment： microdialysis[J] Transdermal Top Drug Deliv Princip Pract， 2011： 131

[4]Lan Yi， Wang Jingyan， He Shuwang， et al Transdermal permeation of Zanthoxylum bungeanum essential oil on TCM components with different lipophilicity[J] J Tradit Chin Med Sci， 2016， 3（3）： 157

[5]Lan Yi， Wu Qing， Mao Yingqiu，et al Cytotoxicity and enhancement activity of essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim as a natural transdermal penetration enhancer[J] J Zhejiang Univ SCI B， 2014， 15（2）： 153

[6]Benfeldt E， Serup J， Menne T Microdialysis vs suction blister technique for in vivo sampling of pharmacokinetics in the human dermis[J] Acta Derm Venereol， 1999， 79（5）： 338

[7]丁平田，魏剛，李虹，等 濃差法用于微滲析回收率的測定[J] 中國藥學雜志， 2001， 36（10）： 690

[8]Matsuyama K， Nakashima M， Ichikawa M， et al In vivo microdialysis for the transdermal absorption of valproate in rats[J] Biol Pharm Bull， 1994， 17（10）： 1395

[9]Potts R O， Guy R H Predicting skin permeability[J]Pharm Res， 1992， 9 （5）： 663

[10]Lee C K， Uchida T， Kitagawa K， et al Skin permeability of various drugs with different lipophilicity[J] J Pharm Sci， 1994， 83 （4）： 562

[責任編輯孔晶晶]