劉穎 朱以軍 王月

金華地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型及耐藥基因位點(diǎn)突變類型分析

劉穎 朱以軍 王月

目的 分析金華地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布特征及HBV耐藥基因位點(diǎn)突變情況，并探討兩者的關(guān)系。方法 選取104例經(jīng)核苷（酸）類似物治療的慢性乙型肝炎患者為研究對(duì)象，采用Sanger雙脫氧法測(cè)序技術(shù)檢測(cè)患者血清HBV的基因型和10種常見(jiàn)的HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變情況，并分析兩者關(guān)系。 結(jié)果 本組慢性乙型肝炎患者中，HBV B基因型占46.15%，C基因型占53.85%，未發(fā)現(xiàn)其他基因型。檢測(cè)出發(fā)生耐藥基因位點(diǎn)突變61例，突變率為58.65%，其中C基因型占65.57%，B基因型占34.43%。HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變率最高的為M204V/I（73.85%），其次為L(zhǎng)180M（36.92%）和A181V/T（23.08%）。HBVP區(qū)耐藥基因發(fā)生單位點(diǎn)突變的占50.82%，其中M204I突變類型最多（29.51%）；發(fā)生多位點(diǎn)突變的占49.18%；以M204I和M204V/I+L180M兩種突變類型最常見(jiàn)。HBVC基因型的患者耐藥基因突變率高于B基因型的患者（71.43%vs 43.75%，P＜0.05），其中C基因型的患者A181V/T位點(diǎn)突變率高于B基因型的患者（14.29%vs 2.08%，P＜0.05）。 結(jié)論 金華地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型為主；HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變類型以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見(jiàn)；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易發(fā)生耐藥突變，且更易發(fā)生A181V/T位點(diǎn)突變。

慢性乙型肝炎 耐藥突變 基因型 核苷（酸）類似物

HBV感染呈世界性流行，WHO估計(jì)全世界約有3.5～4億人感染HBV[1]。我國(guó)是一個(gè)肝炎大國(guó)，據(jù)2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率為0.96%。據(jù)此推算，我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬(wàn)人[2-3]。目前HBV已發(fā)現(xiàn)有A～I(xiàn) 9個(gè)基因型，在我國(guó)以C基因型和B基因型為主。研究表明，HBV基因型與疾病進(jìn)展和干擾素（IFN）α治療效果有關(guān)；與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌；HBeAg陽(yáng)性患者對(duì)IFNα治療的應(yīng)答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型[1]。慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物主要為兩大類：IFN和核苷（酸）類似物（NAs）。目前臨床上應(yīng)用的抗HBV的NAs有5種：拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定和替諾福韋酯。隨著NAs長(zhǎng)期廣泛的應(yīng)用，HBV反轉(zhuǎn)錄酶（RT）基因的突變也明顯增加，使慢性乙型肝炎的抗病毒治療變得更為復(fù)雜。因此，本研究探討金華地區(qū)HBV基因型分布和慢性乙型肝炎患者HBV P區(qū)耐藥基因突變情況，以期為臨床慢性乙型肝炎抗病毒治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015年10月至2016年10月本院收治的慢性乙型肝炎患者104例，其中男77例，女27例；年齡22～69（42.8±12.1）歲。所有患者均符合2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)和感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且所有患者都有NAs抗病毒治療的用藥史。

1.2 儀器和試劑 ABI3500測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo scientific公司，型號(hào)FRESCO 17）、凝膠成像分析儀（美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)ChemiDoc XRS+）、瓊脂糖凝膠電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、普通DNA純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、HBV耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、PCR擴(kuò)增試劑（日本TaKaRa公司，型號(hào)PrimeSTAR HS PREMIX）。

1.3 標(biāo)本采集 采用促凝分離膠真空采血管采集患者外周血3ml，離心后將血清轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HBV P區(qū)耐藥基因突變位點(diǎn) 包括10個(gè)位點(diǎn)：I169T、V173L、L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、A194T、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I。該10個(gè)位點(diǎn)均為國(guó)內(nèi)外臨床公認(rèn)，且為美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療HBV的所有NAs的耐藥突變相關(guān)位點(diǎn)。

1.5 HBV基因型和HBV P區(qū)耐藥基因檢測(cè) HBV P區(qū)耐藥基因檢測(cè)采用Sanger雙脫氧法測(cè)序技術(shù)，使用HBV耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。PCR擴(kuò)增出HBV P區(qū)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定和純化后，進(jìn)行測(cè)序PCR，將測(cè)序PCR產(chǎn)物純化后在ABI3500測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。最后將測(cè)序得到的基因序列在CelLoud平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到HBV基因型和耐藥突變位點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型分布 本組慢性乙型肝炎患者中B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%；未檢測(cè)到其他類型的基因型。

2.2 HBV P區(qū)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 本組慢性乙型肝炎患者中有61例檢測(cè)到耐藥基因突變，突變率為58.65%。在所檢測(cè)的10個(gè)突變位點(diǎn)中有9個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到突變：L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I、V173L、I169T；A194T位點(diǎn)未檢測(cè)到突變。HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變率情況見(jiàn)圖1，突變類型見(jiàn)表1。

圖1 HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變率情況

由圖1可見(jiàn)，HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變率最高的為M204V/I，其次為L(zhǎng)180M，第3為A181V/T。

由表1可見(jiàn)，HBV P區(qū)耐藥基因發(fā)生單位點(diǎn)突變的有31例（50.82%），其中M204I突變類型最多；發(fā)生多位點(diǎn)突變的有30例（49.18%）；未檢測(cè)到L180M位點(diǎn)單突變，L180M突變伴隨M204V/I突變出現(xiàn)。

2.3 HBV基因型與HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變類型的關(guān)系 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，HBV B基因型的患者與C基因型的患者P區(qū)耐藥基因突變率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），C基因型的患者高于B基因型的患者；其中C基因型的患者A181V/T位點(diǎn)突變率高于B基因型的患者（P＜0.05）。

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)HBV基因型有A～I(xiàn) 9種基因型，我國(guó)主要以B基因型和C基因型為主。HBV基因型分布具有明顯的地理差異，我國(guó)北方以C基因型為主，我國(guó)南方以B基因型為主[4-6]。本組104例慢性乙型肝炎患者中，B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%，未發(fā)現(xiàn)其他基因型。這說(shuō)明金華地區(qū)HBV基因型以B型和C型為主，C基因型略高于B基因型。這可能與金華地區(qū)流動(dòng)人口較多有關(guān)。馬幼麗等[7]的研究結(jié)果提示浙江HBV基因型以C基因型為主。

表1 HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變類型

表2 HBV基因型與HBVP區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變類型的關(guān)系[例（%）]

HBV P區(qū)位點(diǎn)的基因突變是HBV對(duì)NAs發(fā)生耐藥的重要原因之一。本研究結(jié)果顯示，在104例慢性乙型肝炎患者中，有61例患者發(fā)生了不同程度的HBV P區(qū)耐藥基因突變，突變率為58.65%。其中發(fā)生單位點(diǎn)突變有31例，多位點(diǎn)突變有30例。突變率最高的突變位點(diǎn)是M204V/I位點(diǎn)，突變率為73.85%，其次是L180M位點(diǎn)，但是L180M突變是伴隨M204V/I突變出現(xiàn)，未檢測(cè)到L180M單位點(diǎn)突變。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[8-9]。有研究指出L180M這個(gè)位點(diǎn)的伴隨性突變能夠增強(qiáng)HBV的復(fù)制能力，同時(shí)抵抗拉米夫定的病毒抑制作用[10]。本研究中HBV P區(qū)耐藥基因突變模式多樣，61例發(fā)生HBV P區(qū)耐藥基因突變的慢性乙型肝炎患者中，有30例（49.18%）患者發(fā)生多位點(diǎn)突變。這提示，金華地區(qū)慢性乙型肝炎的患者發(fā)生HBV P區(qū)耐藥基因突變率較高且易發(fā)生多位點(diǎn)耐藥基因突變；在發(fā)生A181V/T位點(diǎn)突變中，C基因型患者的突變率明顯高于B基因型。

《HBV耐藥專家共識(shí)：2009年更新》中指出拉米夫定常見(jiàn)耐藥相關(guān)變異為204I/V±rtLl80M，其中rtM204V多與rtL180M變異聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I變異可單獨(dú)出現(xiàn)。阿德福韋耐藥相關(guān)變異為rtN236T與rtA181V/T變異，2個(gè)位點(diǎn)變異可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)。恩替卡韋相關(guān)變異是在rtM204V+rtL180M變異基礎(chǔ)上，聯(lián)合rtT184、rtS202或rtM250 3個(gè)位點(diǎn)中至少1個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代變異。替比夫定常見(jiàn)的耐藥相關(guān)位點(diǎn)為rtM204I[11]。本研究結(jié)果顯示，在所檢測(cè)到耐藥基因突變類型中以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見(jiàn)，占50.82%（31/61），這個(gè)結(jié)果與北京佑安醫(yī)院的研究結(jié)果相同[12]。這兩種突變類型是拉米夫定和替比夫定耐藥最易發(fā)生的類型，說(shuō)明金華地區(qū)慢性乙型肝炎耐藥以拉米夫定和替比夫定為主。L180M+M204V+其他的耐藥基因突變類型占18.03%（11/61），說(shuō)明金華地區(qū)發(fā)生恩替卡韋的耐藥率相對(duì)較高。因此采用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV P區(qū)耐藥基因突變對(duì)于抗病毒療效檢測(cè)和抗病毒方案的制定與調(diào)整有重要的意義。

綜上所述，本研究對(duì)金華地區(qū)HBV基因型分布特征和HBV P區(qū)耐藥基因突變位點(diǎn)類型進(jìn)行初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金華地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型為主；HBV P區(qū)耐藥基因位點(diǎn)突變類型多樣，以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見(jiàn)；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易發(fā)生耐藥突變，且更易發(fā)生A181V/T位點(diǎn)突變。

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Genotypes and mutation patterns of HBV gene in chronic hepatitis B patients in Jinhua

LIU Ying,ZHU Yijun,WANG Yue. Department of Central Laboratory,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Chronic hepatitis B Resistance mutation Genotype Nucleoside analogues

2017-04-21）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-905

321000 金華市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

劉穎，E-mail：liuyingtj2008@sina.com

【 Abstract】 Objective To analyze genotypes and mutation patterns of HBVgene in chronic hepatitis B patients in Jinhua. Methods One hundred and four patients with chronic hepatitis B who were treated with nucleoside analogues,were enrolled in the study.Sanger sequence analysis of HBV genotypes and 10 common sites of HBV P region were performed. Results There were 46.15%cases of B genotype and 53.85%of C genotype among 104 chronic hepatitis B patients.Other genotypes were no detected.HBV P gene mutation were detected in 61 cases (58.65%);there was 65.57%in HBV C genotype and 34.43%in B genotype.M204V/I was the most common site of HBV P gene mutation (73.85%),followed by L180M (36.92%)and A181V/T (23.08%).50.82%cases had single site mutation and the most mutation pattern was M204I(29.51%);and 49.18%had multiple sites mutation;the most common mutation patterns were M204I and M204V/I+L180M.The resistance mutation rate in C genotype was higher than that in B genotype(71.43%vs 43.75%,P＜0.05)and the mutation rate of A181V/T in C genotype cases was higher than that in B genotype cases(14.29%vs 2.08%,P＜0.05). Conclusion Genotype B and C are the main genotypes of HBVin this study.The most common mutation patterns of HBVP gene were M204I and M204V/I+L180M.Genotype C patients had more mutations than genotype B and the A181V/T mutation pattern was more common in genotype C.