朱麗莉，陶宇航，韓 雪，唐繼高，吳松成，李 亮，伍革民

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

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荔波瑤山雞POU1F1基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)性

朱麗莉，陶宇航，韓 雪，唐繼高，吳松成，李 亮，伍革民*

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

【目的】為探明荔波瑤山雞POU1F1基因多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系，為荔波瑤山雞的選擇性育種提供參考?！痉椒ā酷槍?duì)POU1F1基因設(shè)計(jì)6對(duì)引物，采用PCR測(cè)序法篩選出多態(tài)位點(diǎn)，并利用荔波瑤山雞母系60個(gè)個(gè)體進(jìn)行繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析?！窘Y(jié)果】荔波瑤山雞POU1F1基因有8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中POU1F1基因58(A→G)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、300日齡就巢次數(shù)均呈顯著或極顯著相關(guān) (P<0.05或P<0.01)；65(T→C)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、300日齡就巢次數(shù)呈顯著相關(guān) (P<0.05)；11041(T→C)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔均呈顯著或極顯著相關(guān) (P<0.05或P<0.01)?！窘Y(jié)論】POU1F1基因58(A→G)和65(T→C)可作為300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡和300日齡就巢次數(shù)的輔助選擇標(biāo)記；11041(T→C)可作為300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔的輔助選擇標(biāo)記。

POU1F1基因；基因多態(tài)位點(diǎn)；荔波瑤山雞；繁殖性狀

【研究意義】禽類在自然狀態(tài)下產(chǎn)蛋到一定階段就會(huì)產(chǎn)生就巢行為，大多數(shù)家禽尤其是地方品種仍然保持著或強(qiáng)或弱的就巢性。禽類就巢性的遺傳機(jī)理比較復(fù)雜，目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，就巢性是由外界環(huán)境、內(nèi)分泌系統(tǒng)、基因表達(dá)相互作用的結(jié)果。下丘腦-垂體-卵巢軸這一神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的主要生理功能是控制雌性動(dòng)物的性功能，涉及多種激素，這些激素由多基因表達(dá)調(diào)控。垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子(Pituitary Specific Transcriptiona Factorl，POU1F1)是動(dòng)物垂體前葉特異表達(dá)的一種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)的產(chǎn)物通過與垂體(Prolactin，PRL)、生長(zhǎng)激素(Growth Hormone，GH)和促甲狀腺素亞β單位(Thyroid Stimulating Hormoneβ，TSHβ)基因以及POU1F1自身的調(diào)控元件結(jié)合，調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和免疫等很多方面起重要的調(diào)控作用[1-3]。因此，關(guān)于該基因的遺傳變異分析及其與生物性狀關(guān)系的研究顯得極其重要。【前人研究進(jìn)展】荔波瑤山雞是貴州優(yōu)良地方雞品種資源之一，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩等特點(diǎn)，可作為優(yōu)質(zhì)雞育種的重要素材，但其產(chǎn)業(yè)發(fā)展受限于其重要經(jīng)濟(jì)性能偏低，尤其是開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋量、就巢性等繁殖性能偏低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】繁殖性狀是多基因控制的復(fù)雜性狀，受多基因效應(yīng)影響，其遺傳力低，僅通過常規(guī)選育方法難以完全剔除就巢性而提高繁殖力的問題。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用PCR測(cè)序法，分析荔波瑤山雞POU1F1基因多態(tài)性與雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，探討POU1F1基因的多態(tài)位點(diǎn)作為繁殖性狀遺傳標(biāo)記的可行性，以期為荔波瑤山雞的選擇性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 荔波瑤山雞

試驗(yàn)荔波瑤山雞選自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場(chǎng)，60只母雞。群體一致性較好，性能較為穩(wěn)定。所有個(gè)體均采用常規(guī)飼養(yǎng)管理，個(gè)體籠養(yǎng)。翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 性狀測(cè)定

120 日齡母雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單個(gè)籠養(yǎng)至300 日齡，逐個(gè)測(cè)定開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重、就巢性等繁殖性狀，測(cè)定方法按照NY/T 823-2004[4]進(jìn)行。

1.3 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據(jù)GenBank中雞的POU1F1基因序列(登錄號(hào)：NM_204319)，合成6對(duì)引物(表1，由天根生化科技有限公司合成)檢測(cè)POU1F1基因在荔波瑤山雞60個(gè)個(gè)體中的基因型遺傳變異情況。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR反應(yīng)體系20 μl：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×TaqPCR MasterMix 試劑10 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性30 s，按引物的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托諾賽基因組研究中心有限公司純化回收后進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異情況。用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。用Spss 18.0軟件，采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)位點(diǎn)及遺傳多態(tài)性

6對(duì)引物在荔波瑤山雞POU1F1基因中共檢測(cè)出8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(表2)，其中引物1檢測(cè)出5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，位于外顯子1和內(nèi)含子1上；引物3檢測(cè)出1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，位于內(nèi)含子3上；引物5和引物6各檢出1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均位于外顯子6上；引物2和引物4未檢出多態(tài)位點(diǎn)。

根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)及基因型，計(jì)算POU1F1基因8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率(表2)。8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的多肽信息含量在0.12～0.36。

表1 用于荔波瑤山雞POU1F1基因型檢測(cè)的引物信息

表2 荔波瑤山雞POU1F1基因的8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及其遺傳多態(tài)性

2.2 8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

POU1F1基因的8個(gè)突變位點(diǎn)分別位于外顯子1的58(A→G)和65(T→C)，內(nèi)含子1的332(G→A)、335(A→G)和372(A→G)，內(nèi)含子3的3171(A→T)，外顯子6的11041(T→C)和12188(T→C)。經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，外顯子1的58(A→G)和65(T→C)2個(gè)位點(diǎn)，外顯子6的11041(T→C)位點(diǎn)分別與不同繁殖性狀存在顯著或極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05或P<0.01)；其余5個(gè)突變位點(diǎn)與繁殖性狀關(guān)聯(lián)不顯著(表3)。

2.3 3個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性

POU1F1基因58(A→G)位點(diǎn)變異不改變蛋白質(zhì)編碼。該位點(diǎn)檢測(cè)出AA和GG 2種基因型，未發(fā)現(xiàn)AG雜合型。設(shè)計(jì)引物參照的NCBI序列以AA基因型為主，而檢測(cè)的荔波瑤山雞樣本以GG基因型為主。經(jīng)比較，GG型比AA型的300日齡產(chǎn)蛋量多31.89枚，首次就巢日齡推遲53.57 d，差異均顯著；300日齡就巢次數(shù)少2.07次，差異極顯著(表4)。

POU1F1基因65(T→C)位點(diǎn)變異不改變蛋白質(zhì)編碼。該位點(diǎn)檢測(cè)出TC、TT和CC 3基因型。設(shè)計(jì)引物參照的NCBI序列以TT基因型為主，而檢測(cè)的荔波瑤山雞樣本以CC基因型為主。該位點(diǎn)CC型、TC型分別比TT型的300日齡產(chǎn)蛋量多30.84和22.00枚，差異均顯著；300日齡就巢次數(shù)分別少2.04和2.33次，差異均顯著；CC型的首次就巢日齡分別比TC型、TT型晚47.31和58.31 d，差異均顯著。

表3 荔波瑤山雞POU1F1基因8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與不同繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

注：NS表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:NS means not significant difference between treatments(P>0.05).

表4 荔波瑤山雞POU1F1基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與不同繁殖性狀的相關(guān)性

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercase and capital letters in the same row means significant difference at 5 % and 1 % significant levels respectively.

POU1F1基因11041(T→C)位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)第279位的異亮氨酸發(fā)生同義突變[I(AUU→AUC)]。該位點(diǎn)TT型、TC型分別比CC型的300日齡產(chǎn)蛋量多40.14和36.55枚，差異均顯著；TT型比CC型的首次就巢持續(xù)時(shí)間少20.75 d，TC型比CC型少13.04 d，差異均顯著；TT型比CC型的首次就巢至重新開產(chǎn)間隔少7.25 d，差異均顯著。

3 討 論

雞POU1F1基因定位于1號(hào)染色體上，DNA序列全長(zhǎng)13 416 bp，有6個(gè)外顯子。目前，POU1F1基因與家禽生長(zhǎng)性能的相關(guān)性已有大量研究。XU H Y等[5]研究發(fā)現(xiàn)，POU1F1基因T96217999C與山雞的屠宰性狀極顯著相關(guān)(P<0.01)，C96219442T 則顯著相關(guān)(P<0.05)。JIANG R等[6]對(duì)POU1F1基因單核苷酸的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，AA 基因型與雞個(gè)體體重呈正相關(guān)。胡玉萍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，POU1F1 基因第3外顯子的 5231 bp 位置有A—T 堿基的點(diǎn)突變，顯著(P<0.05)影響京海黃雞的周齡體重。廉婷等[8]對(duì)二郎山山地雞研究表明，大體重組的300 日齡總產(chǎn)蛋數(shù)極顯著(P<0.01)高于中、小體重組。此外，POU1F1基因與雞個(gè)體體重為主的生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)(P<0.05)[9-12]。POU1F1 基因是影響雞生長(zhǎng)性狀(體重)的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標(biāo)記基因，而體重是影響家禽開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋量等繁殖性狀的重要因素之一，POU1F1 基因可作為禽類繁殖性能的標(biāo)記基因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，POU1F1基因第6外顯子遺傳變異與雞的繁殖性能存在顯著相關(guān)[9]；外顯子3上的突變(A5331T)，CC型個(gè)體的72周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于DD型和CD型(P<0.05)[13]；第3外顯子的G3109A對(duì)狼山雞16周齡體重和300日齡產(chǎn)蛋量有顯著影響(P<0.05)[14]；POUlFl基因的外顯子3、4和6上的6個(gè)SNP均與藏雞產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)(P<0.05)[15]；鴨中POU1F1基因第2內(nèi)含子AA基因型個(gè)體的蛋形指數(shù)和4周齡體重均顯著高于aa型(P<0.05)[16]。荔波瑤山雞POU1F1基因上有8個(gè)SNP，其中第6外顯子上11041(T→C)變異與300日齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)，與姜潤(rùn)深等[9,15]的研究結(jié)果一致；同時(shí)第1外顯子的58(A→G)和65(T→C)變異與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡和300日齡就巢次數(shù)顯著相關(guān)。

4 結(jié) 論

荔波瑤山雞POU1F1基因有8個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于外顯子1的58(A→G)和65(T→C)，內(nèi)含子1的332(G→A)、335(A→G)和372(A→G)，內(nèi)含子3的3171(A→T)，外顯子6的11041(T→C)和12188(T→C)。其中，POU1F1基因58(A→G)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡均顯著相關(guān)(P<0.05)，與300日齡就巢次數(shù)極顯著相關(guān) (P<0.01)；65(T→C)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、300日齡就巢次數(shù)均顯著相關(guān) (P<0.05)；11041(T→C)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔呈顯著相關(guān)(P<0.05)，與首次就巢持續(xù)時(shí)間極顯著相關(guān)(P<0.01)。POU1F1基因58(A→G)和65(T→C)可作為300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡和300日齡就巢次數(shù)的輔助選擇標(biāo)記；11041(T→C)可作為300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔的輔助選擇標(biāo)記。

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(責(zé)任編輯 馮 衛(wèi))

Association of Polymorphic Sites of GenePOU1F1 with Chicken Egg Laying Traits

ZHU Li-li，TAO Yu-hang，HAN Xue，TANG Ji-gao，WU Song-cheng，LI Liang，WU Ge-min*

(Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】 The stydy aims to analyze the associations of genePOU1F1 with chicken egg laying traits and provide references for selection breeding of Libo Yaoshan chicken. 【Method】 Six primers were designed and eight polymorphic sites were selected, and the association analysis was performed in 60 chickens of Libo Yaoshan female line by PCR-sequencing methods. 【Result】58(A→G) mutation sites were significantly associated with the total egg number from 120 to 300 d of age (EN300), age at first broodiness behavior (AFBB) and times of broodiness behavior from 120 to 300 d of age (TBB300) (P<0.05 orP<0.01). 65(T→C) mutation sites were significantly associated with EN300, AFBB and TBB300 (P<0.05). 11041(T→C) mutation sites were significantly associated with EN300. Duration of age at first broodiness behavior (DAFBB) and interval of age at first broodiness behavior between anew laying (IAFBBA) (P<0.05 orP<0.01). 【Conclusion】58(A→G) and 65(T→C) may be regarded as an effective molecular marker on the MAS(Marker Assisted Selection)program for EN300, AFBB and TBB300; 11041(T→C) may be regarded as an effective molecular marker for EN300, DAFBB and IAFBBA.

GenePOU1F1; Polymorphic site; Libo Yaoshan chicken; Egg laying trait

1001-4829(2017)7-1675-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.037

2016-11-30

貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目“瑤山雞ONECUT1基因的CDS區(qū)克隆、差異表達(dá)及與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析”[黔科合LH字(2015)7067]；貴州省基金項(xiàng)目“瑤山雞就巢性選育關(guān)鍵基因篩選”[黔科合J字(2014)2102]；貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種項(xiàng)目“瑤山雞新品系選育與推廣”[黔農(nóng)育專字(2014)008]；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2014年博士基金項(xiàng)目“瑤山雞STAT5基因變異檢測(cè)及與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析”；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院專項(xiàng)“長(zhǎng)順綠殼蛋雞綠殼表型遺傳標(biāo)記的篩選與應(yīng)用”[黔農(nóng)科院院專項(xiàng)(2014)006]，“百宜黑雞高產(chǎn)純繁核心種群選育與示范推廣”[黔農(nóng)科院院專項(xiàng)(2014)038]；市院地合作項(xiàng)目“喀斯特地形山地肉雞養(yǎng)殖技術(shù)推廣”[院地農(nóng)科合字(2014)10]

朱麗莉(1984-)，女，四川成都人，副研究員，碩士，從事家禽遺傳育種研究，E-mail: zhuerms@163.com，*為通訊作者：伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。

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