易華山，畢俊萱，馬鮮平，唐明霞，張德志，王芝英

(西南大學(xué) 榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460)

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豬流行性腹瀉病毒 ORF3基因的克隆及序列分析

易華山，畢俊萱，馬鮮平，唐明霞，張德志，王芝英

(西南大學(xué) 榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460)

為研究2015年重慶市榮昌部分腹瀉豬場(chǎng)是否有豬流行性腹瀉病毒的感染與流行，對(duì)豬流行性腹瀉病毒 ORF3(Open reading flame 3)基因進(jìn)行克隆及序列分析研究。通過(guò)從疑似流行性腹瀉病毒感染的豬場(chǎng)采集小腸組織，采用RT-PCR方法對(duì)豬流行性腹瀉病毒的 ORF3基因進(jìn)行克隆。結(jié)果表明，所獲得的 ORF3基因ORF長(zhǎng)675bp，編碼223個(gè)氨基酸。通過(guò)DNAMAN軟件分析，表明本研究中克隆的 ORF3基因與CV777標(biāo)準(zhǔn)株(AF353511)的 ORF3基因相似性為96.45%，與中國(guó)的NJ(KJ642645)的相似性最高，為99.41%，與attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%，而與CV777疫苗株(GU372744)相似性?xún)H79.07%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因與中國(guó)毒株、韓國(guó)毒株以及美國(guó)分離株USA/ Illinois 201/2014 (KR265795)處于同一進(jìn)化分支上，而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和歐洲的CV777標(biāo)準(zhǔn)株處于另一個(gè)進(jìn)化分支上，說(shuō)明該基因與中國(guó)毒株、韓國(guó)毒株的遺傳距離最近。通過(guò) B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸第65～68、114～116、137～140和150～154區(qū)域可能有潛在的優(yōu)勢(shì)抗原表位。成功克隆了豬流行性腹瀉病毒 ORF3 基因，說(shuō)明2015年重慶市榮昌部分腹瀉豬場(chǎng)存在豬流行性腹瀉病毒的感染。

豬流行性腹瀉病毒； ORF3基因；序列分析

豬流行性腹瀉( porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒( porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性接觸性腸道傳染病[1]。PED是世界范圍內(nèi)發(fā)生與流行的豬病之一，1971年在英國(guó)首次被報(bào)道；此后，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道PED，如比利時(shí)、中國(guó)、韓國(guó)等[2-4]。有研究表明，在中國(guó)南部許多省份爆發(fā)PED，超過(guò)100萬(wàn)的仔豬死亡，且出生后7 d內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)80%～100%[1-6]?，F(xiàn)已研制出的PEDV疫苗對(duì)該病的流行在一定程度上起到控制作用，但由于PEDV新變異株的不斷出現(xiàn)，疫苗并不能完全阻斷該病的發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

PEDV由6個(gè)基因組成：纖突基因、小包膜基因、膜基因、核衣殼基因、復(fù)制酶基因和 ORF3基因，其中 ORF3基因?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)基因，長(zhǎng)675 bp，編碼223個(gè)氨基酸，也是PEDV唯一的輔助基因[1-2]。不同PEDV毒株的 ORF3基因存在著不同的可變區(qū)，有短的核苷酸缺失(2～7 bp)，這使 ORF3具有多形態(tài)[6-8]。Park等[9]克隆16個(gè)PEDV不同毒株的 ORF3基因，通過(guò)比較野生型和致弱毒株，發(fā)現(xiàn)致弱的毒株均缺失17個(gè)氨基酸(51個(gè)核苷酸)，推測(cè)這是和病毒毒力有關(guān)的重要位點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn) ORF3基因編碼一種調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的鉀離子通道蛋白，但鉀離子通道蛋白影響病毒致病性的機(jī)制還有待更深入的研究[10]。PEDV與其他冠狀病毒相比，仍有許多研究還不夠深入[11-12]。本試驗(yàn)對(duì)豬流行性腹瀉病毒的 ORF3基因進(jìn)行克隆和序列分析，為進(jìn)一步分析豬流行性腹瀉病毒的分子特征及分子流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 料 于2015年12月從榮昌疑似流行性腹瀉病毒感染的豬場(chǎng)采取小腸樣品，置于液氮中保存待用。

1.1.2 主要試劑 pGEM-T easy載體購(gòu)自美國(guó)promega公司，RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司，DNA片段純化試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker、X-gal和T4DNA連接酶、以及rTaqDNA聚合酶等均購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank收錄的豬PEDV CV777 ORF3基因序列 (AF353511)設(shè)計(jì)并合成引物PEDV ORF3 F1和PEDV ORF3 R1，用于擴(kuò)增從ATG到TAA一個(gè)完整閱讀框的 ORF3基因。引物PEDV ORF3 F：5′-ATGT-TTCTTGGACTTTTTCA-3′，PEDV ORF3 R：5′-TCATTCACCAATTGTAGCATAC-3′。以上引物均由北京華大生物有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 病料處理及組織RNA的提取 取出300 mg液氮中保存的小腸組織置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行充分研磨，取1/3粉未于無(wú)RNA酶的EP管中，加入800 μL Trizol，顛倒混勻10次，按照RNeasy○RMini Kit操作說(shuō)明提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR 對(duì)提取總RNA以O(shè)ligdT及試劑盒隨機(jī)引物，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再以cDNA為模板，以O(shè)RF3 F1和F2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物于0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠中電泳后，按Axygen quick Gel Extraction Kit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化并將純化產(chǎn)物與PGEM-Teasy連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，按質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3 目的基因氨基酸序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 將鑒定正確的重組質(zhì)粒送北京華大生物工程公司測(cè)序，利用Blast在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析；利用在線ExPASy和TMpred進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htmL/page.cgi?id=index;http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func= modelling_simple1;http://www.ebi.ac.uk/interpro/index.htmL)。多序列比對(duì)采用Clustal W和Muscle.exe軟件進(jìn)行，再用MEGA5.0軟件中的Boot-strapped Neighbor-Joining繪制 ORF3基因進(jìn)化樹(shù)分析。應(yīng)用DNAMan軟件對(duì) PEDV ORF3核苷酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)；應(yīng)用DNAStar軟件中的Protean程序預(yù)測(cè)PEDV ORF3的B細(xì)胞抗原表位及利用CBS Prediction servers的TMHMM(http:// www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PEDV ORF3蛋白的跨膜區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV ORF3基因RT-PCR

PEDV ORF3基因經(jīng)過(guò)0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示大約在700 bp處有特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

M.DL-5000 Marker；1.目的基因PCR產(chǎn)物 Target gene PCR product
圖1 PEDV ORF3基因的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增
Fig.1 RT-PCR Amplification of PEDV ORF3 gene

2.2 PEDV ORF3基因菌液PCR鑒定

以陽(yáng)性克隆的重組菌液為模板，以O(shè)RF3 F1和F2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示大約在700 bp處有特異性條帶，表明重組質(zhì)粒中含有目的基因片段(圖2)。

2.3 測(cè)序及序列分析結(jié)果

2.3.1 PEDV ORF3基因序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 經(jīng)測(cè)序表明PEDV ORF3基因的長(zhǎng)度為675 bp，共編碼223個(gè)氨基酸。將PEDV ORF3基因的氨基酸序列同韓國(guó)attenuated DR13疫苗株，英國(guó)CV777標(biāo)準(zhǔn)株、CV777 truncated 疫苗株進(jìn)行同源性分析。ORF3蛋白與CV777標(biāo)準(zhǔn)株相似性為96.45%，與attenuated DR13疫苗株相似性為90.52%，但與CV777 truncated疫苗株相似性?xún)H為79.07%. 運(yùn)用MEGA 5.0將測(cè)得序列與GenBank中檢索的23株相似序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，這些序列分別是中國(guó)的CHQX-02(KF476050)、CH/ZKHFQ/11(JN547394)、CH/T J-2012(KC148525)、CH/HNHJ/08(GU37-2736)、NJ(KJ642645)、GDJM-1205(KC294277)、CH/GSJI/07(GU372737)、FJ/FQ/11(JQ678-038)、CH/JX-2/2013(KJ526096)、JS-HZ2012(KC210147)、SQ/2013(KM890310)、JSBJ2012(KC161189)、ZJ_111128(JX880078)、AHQJ2012(KC161188)，英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株CV777(AF353511)、CV777 truncated 疫苗株(GU372744)，韓國(guó)毒株DR13(EU054929)、attenuated DR13疫苗株(EU054929)、PFF188(FJ687462)、M2227(HQ537439)、KDGG10KA(KJ857438)，法國(guó)分離株Brl/87(Z24733)和美國(guó)分離株USA/Illinois201/2014(KR265795)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因與中國(guó)毒株、韓國(guó)毒株以及美國(guó)分離株USA/ Illinois 201/2014 (KR265795)處于同一進(jìn)化分支上，而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和歐洲的CV777標(biāo)準(zhǔn)株處于另一個(gè)進(jìn)化分支上，表明該基因與中國(guó)毒株、韓國(guó)毒株的遺傳距離最近(圖3)。

M.DL-2000 Marker;1.重組菌液PCR產(chǎn)物 PCR product of recombinant bacteria
圖2 PEDV ORF3重組菌液PCR擴(kuò)增
Fig.2 The amplification of PEDV ORF3 recombinant bacteria

2.3.2 PEDV ORF3蛋白跨膜區(qū) 利用TMHMM對(duì)PEDV ORF3跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，ORF3蛋白的第1～37位、95～223位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，第61～71位氨基酸在細(xì)胞膜外，第38～60位、72～94位氨基酸之間各形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)(圖4)。

圖3 基于PEDV ORF3基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PEDV ORF3 gene

圖4 PEDV ORF3跨膜區(qū)分析Fig.4 PEDV ORF3 transmembrane domain analysis

2.3.3 PEDV ORF3的抗原表位預(yù)測(cè) 利用DNAStar 5.0軟件的Protean程序?qū)EDV ORF3基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性的預(yù)測(cè)分析。通過(guò)Garnier-Robson法算出特定的氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性結(jié)果為：α-螺旋區(qū)域有10個(gè)，β-折疊區(qū)域有16個(gè)，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域有7個(gè)，無(wú)規(guī)則卷曲有4個(gè)。用Chou-Fasman法預(yù)測(cè)的結(jié)果為：5個(gè)α-螺旋區(qū)域，9個(gè)β-折疊區(qū)域，10個(gè)β-轉(zhuǎn)角區(qū)域(圖5)。結(jié)合2種方法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-轉(zhuǎn)角主要集中在第115～157區(qū)域。

采用Kyte-Doolittle的方法對(duì)ORF3的親水性進(jìn)行分析，親水性較高的區(qū)域(>0)有18～21、41～44、62～68、112～116、135～139、150～154、173～182、213～216和218～222(圖6-A)，但總的來(lái)說(shuō)ORF3蛋白的疏水區(qū)域較多，且疏水指數(shù)較高。 采用Jameson-Wolf方法分析PEDV ORF3潛在抗原表位位點(diǎn)，以抗原指數(shù)>0作為條件，結(jié)果表明在第12～24、28～33、40～45、63～71、113～119、132～135、136～144、147～154、173～183和187～194區(qū)域的抗原指數(shù)較高(圖6-B)。 采用Emini方法對(duì)ORF3蛋白表面可及性進(jìn)行分析，以表面可及性指數(shù)>1作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，ORF3氨基酸表面可及區(qū)域主要有16～20、63～70、113～118、135～138、138～141、174～180、191～193和215～218(圖6-C)。 利用Schulz方法對(duì)ORF3的柔韌性進(jìn)行分析，ORF3骨架區(qū)主要有10個(gè)柔性區(qū)域，分別為第11～21、39～46、62～69、125～128、132～134、139～142、147～151、156～158、172～178和188～141位(圖6-D)。

3 結(jié)論與討論

3.1 PEDV ORF3基因同源性比對(duì)分析

對(duì)PEDV ORF3基因核苷酸序列同源性分析可得，本研究中克隆的ORF3蛋白與CV777標(biāo)準(zhǔn)株相似性為96.45%，與attenuated DR13疫苗株相似性為90.52%，但與CV777 truncated疫苗株相似性?xún)H為79.07%。表明疫苗株與流行株之間存在不同程度的核苷酸差異，可能使動(dòng)物體在免疫后仍達(dá)不到較好的免疫保護(hù)效果,甚至導(dǎo)致免疫失敗，這也是目前PEDV在免疫后豬場(chǎng)仍存在流行的原因之一[13]。系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明，PEDV ORF3基因在進(jìn)化上劃分成2個(gè)主分支，本研究克隆的 ORF3基因、中國(guó)毒株、韓國(guó)毒株以及美國(guó)毒株USA/ Illinois 201/2014處于同一進(jìn)化分支上，其中與中國(guó)毒株NJ(KJ642645)的遺傳距離最近，且它們之間的相似性最高，為99.41%；而疫苗株和歐洲分離的標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777、Brl/87毒株則與分離株的遺傳距離較遠(yuǎn)，這與其他研究報(bào)道基本一致[14-15]，表明中國(guó)近幾年來(lái)流行PEDV株發(fā)生變異，并可能來(lái)自韓國(guó)。

A.α-螺旋 α- helical regions ;B.β-折疊 β- folding regions;T.β-轉(zhuǎn)角 β- Turn regions;C.無(wú)規(guī)卷曲 Coil region ;S.位置刻度 Scale of locationg;g.Garnier-Robson法 Method of Gamier-Robson; c.Chous-Fasman法 Method of Chou-Fasman
圖5 PEDV ORF3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)
Fig.5 PEDV ORF3 protein secondary structure

圖6 PEDV ORF3蛋白親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity plot,antigenic index,surface probability and flexible regions of ORF3 protein in Rongchang

3.2 PEDV ORF3 氨基酸序列比對(duì)分析

通過(guò)對(duì)PEDV ORF3氨基酸序列比對(duì)分析得到，該基因與標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777相比，除了有部分點(diǎn)突變外，沒(méi)有缺失和插入，具有完整的開(kāi)發(fā)閱讀框；然而將attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株與標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)疫苗株均有連續(xù)的氨基酸缺失。其中attenuated DRl3疫苗株在第82～98位上缺失17個(gè)氨基酸，CV777 truncated疫苗株在第83～97位上缺失15個(gè)氨基酸。Park等[16]對(duì)PEDV ORF3基因全長(zhǎng)分析表明，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)致弱的PEDV DR13菌株有17個(gè)氨基酸缺失，此缺失未在野生型中得到確定。因此，可推測(cè)PEDV ORF3氨基酸的變化可能誘導(dǎo)毒株毒力發(fā)生改變，本研究中所克隆的 ORF3基因有可能是來(lái)源于PEDV 強(qiáng)毒株。由于PEDV野毒株和細(xì)胞培養(yǎng)致弱株 ORF3基因間存在這種連續(xù)氨基酸的缺失,可將PEDV在細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)并致使 ORF3基因缺失，從而使病毒毒力降低[13,17]。同時(shí)，可以根據(jù) ORF3基因的差異來(lái)鑒別PEDV野毒株與細(xì)胞適應(yīng)型毒株，也為強(qiáng)弱毒株的鑒別診斷提供依據(jù)[16-18]。

3.3 PEDV ORF3 B細(xì)胞抗原表位分析

通過(guò)對(duì)ORF3蛋白的親水性、可及性、柔韌性、抗原指數(shù)進(jìn)行分析可得，該蛋白在第65～68、114～116、137～140和150～154位氨基酸區(qū)域具有B細(xì)胞抗原表位潛力。抗原表位又稱(chēng)為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞?？乖部赏ㄟ^(guò)抗原表位與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而引起免疫效應(yīng)，抗原表位的空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和數(shù)目對(duì)抗原的特異性都會(huì)產(chǎn)生影響[19-20]?？偟膩?lái)說(shuō)，抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。對(duì)PEDV ORF3基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)含有較多的α-螺旋、β-折疊及一定量的轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，表明該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲為突出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，結(jié)構(gòu)松散且易發(fā)生扭轉(zhuǎn)，利于結(jié)合抗原，因而成為B細(xì)胞抗原表位的可能性較大[20-21]。對(duì)PEDV ORF3蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析可知，在第38～60、72～94位氨基酸之間形成2個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)?？缒^(qū)是蛋白質(zhì)序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，多數(shù)為α-螺旋結(jié)構(gòu)，大約由20個(gè)強(qiáng)疏水性氨基酸組成[22]。自然狀態(tài)下，疏水性氨基酸被包埋在蛋白內(nèi)部，很難與抗體結(jié)合，故通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)對(duì)ORF3蛋白表達(dá)應(yīng)考慮其跨膜區(qū)來(lái)篩選抗原表位[21]。也有研究表明，中國(guó)豬場(chǎng)中PEDV引致的豬流行性腹瀉已對(duì)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展造成巨大威脅，PEDV同其他病原的混合感染往往又加劇了疫情的蔓延，同時(shí)疫苗免疫的豬場(chǎng)也爆發(fā)PEDV，因此亟需研究PEDV新型疫苗，然而對(duì)病毒抗原表位的不斷深入研究，不僅可以全面地了解、掌握抗原結(jié)構(gòu)，而且對(duì)疾病的預(yù)防、診斷、治療及表位疫苗的構(gòu)建都起著重要作用[3,23-25]。

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(責(zé)任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Cloning and Sequence Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus ORF3 Gene.

YI Huashan,BI Junxuan,MA Xianping,TANG Minxia,ZHANG Dezhi and WANG Zhiying.

(Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus,Southwest University,Chongqing 402460，China)

To study whether some of pig farms with diarrhea was infected by porcine epidemic diarrhea virus in Rongchang of Chongqing,we cloned and analyzed sequence of the open reading flame 3( ORF3) gene of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)in this study. The small intestine tissue from piglets suffering from a severe diarrhea was collected. The PEDV ORF3 gene was amplified by using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) . The results showed that the amplified PEDV ORF3 gene contained 675 bp nucleotides sequence and encoded 223 amino acids. The similarity of the ORF3 gene between the cloned gene and the CV777 standard strain (AF353511) was 96.45%. The highest similarity also showed that it was 99.41% from the China NJ(KJ642645) by DNAMAN software analysis. The ORF3 Gene shared homology at 90.52% with the DR13 vaccine strain(EU054930),while CV777 vaccine strain shared the lowest nucleotide homology at 79.07%. The phylogenetic analysis showed that the cloning gene and China strain,South Korea and the United States USA/ Illinois strains isolated from 201/2014 (KR265795) were in the same evolutionary branch,which they had a close phylogenetic ralationship. While attenuated DR13 and CV777 truncated vaccine strains and the European CV777 standard strain was in another evolutionary branch. The results showed that the amino acid 65-68,114-116,137-140 and 150-154 regions may have potential advantage of epitopes by B cell epitope prediction analysis. We cloned porcine epidemic diarrhea virus ORF3 gene and the studies proved that porcine epidemic diarrhea virus was infected in part of pig farms with diarrhea in Rongchang of Chongqing in 2015.

Porcine epidemic diarrhea virus; ORF3 gene;Sequence analysis

2016-10-13 Returned 2016-12-01

Rongchang Campus Youth Science Foundation of Southwest University (No.RC20700925&RC20700421); Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.XDJK2015C032).

YI Huashan,male,lecturer.Research area:veterinary clinical infection and immunity and pathogenic molecular biology. E-mail:lzyhsh@163.com

WANG Zhiying,female,senior experimentalist.Research area:infectious diseases and parasitology of domestic animal. E-mail:wangzhiying402460@163.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.012.html

2016-10-13

2016-12-01

西南大學(xué)榮昌校區(qū)青年科學(xué)基金(RC20700925&RC20700421)；中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金(XDJK2015C032)。

易華山，男，講師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床感染與免疫及病原分子生物學(xué)。E-mail：lzyhsh@163.com

王芝英，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榧倚髠魅静〖凹纳x(chóng)學(xué)。E-mail：wangzhiying402460@163.com

S851.34

A

1004-1389(2017)07-0968-07