探討hsa-miR-199a-5p表達(dá)對缺血性腦卒中的預(yù)測作用

惠素艷

探討hsa-miR-199a-5p表達(dá)對缺血性腦卒中的預(yù)測作用

惠素艷

目的：探討hsa-miR-199a-5p在缺血性腦卒中（IS）患者血清中的表達(dá)和意義。方法：收集118例IS患者及125例健康人群的血清標(biāo)本。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測血清hsa-miR-199a-5p的表達(dá)，用ROC曲線分析hsa-miR-199a-5p表達(dá)應(yīng)用于診斷IS的價(jià)值，并對hsa-miR-199a-5p表達(dá)與研究人群的臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：hsa-miR-199a-5p在IS患者中的表達(dá)顯著高于健康人群（P＜0.05），且IS患者在疾病的急性期、亞急性期和恢復(fù)期時(shí)hsa-miR-199a-5p的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的降低趨勢（P＜0.05）。hsa-miR-199a-5p的表達(dá)與IS患者血清CRP水平呈顯著正相關(guān)（r=0.782，P＜0.05）。ROC預(yù)測結(jié)果顯示，hsa-miR-199a-5p診斷IS的靈敏度為94.8%，特異度為96.2%，曲線下面積（AUC）為0.812（95%CI為0.613～0.919，P=0.003）。結(jié)論：hsa-miR-199a-5p或許可成為IS的生物標(biāo)志物。

hsa-miR-199a-5p；缺血性腦卒中；表達(dá)；意義

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中最常見的一種類型，以高致殘率和病死率等特點(diǎn)嚴(yán)重威脅人類生命安全[1,2]。然而，目前對IS的治療尚無特效藥物，因此采取有效措施控制疾病的發(fā)病率具有重要意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNAs）作為一類調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA，在IS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，如胡亞梅[3]等發(fā)現(xiàn)miR-146aG等位基因，miR-149C等位基因與漢族人群缺血性腦卒中易感性有一定的相關(guān)性。hsa-miR-199a-5p作為miRNA中的一員，定位于19號染色體，有學(xué)者通過microRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)在腦卒中患者的外周血中包括hsa-miR-199a-5p在內(nèi)的數(shù)個(gè)基因表達(dá)升高[4]。然而，目前關(guān)于hsa-miR-199a-5p與腦卒中患者的關(guān)系國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道?；诖耍狙芯客ㄟ^對IS患者及健康成人外周血hsa-miR-199a-5p表達(dá)水平進(jìn)行分析，并分析其表達(dá)與IS臨床特征的關(guān)系，為hsamiR-199a-5p在IS發(fā)病中的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年6月至2016年3月我院收治的IS患者118例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》（1995）中關(guān)于腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②患者于發(fā)病后24 h內(nèi)入院，美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIH stroke scale，NIHSS）評分為4～15分。男62例，女56例；年齡56～74歲，平均（68.5±7.2）歲；高血壓66例（55.93%），糖尿病20例（16.95%），高血脂35例（29.66%），吸煙42例（35.59%）；CRP（8.79±3.36）mg/L；NIHSS評分平均（8.34±2.10）分。另選擇同期在我院健康體檢中心體檢，并與觀察組年齡、性別等相匹配的健康人125例為對照組，排除既往有腦卒中病史、頭部手術(shù)史或神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。男67例，女58例；年齡56～74歲，平均（69.1±7.5）歲；高血壓34例（27.20%），糖尿病8例（6.40%），高血脂13例（10.40%），吸煙25例（20.00%）；CRP（4.63±2.32）mg/L。2組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2組高血壓、高血脂、糖尿病和吸煙所占的比例、血清CRP水平與NIHSS評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol?試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒和micro RNA SYRB Green實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DEPC試劑購自美國Sigma公司，Rotor-Gene 3000 Real-time PCR儀器購自德國Qiagen公司，5417R小型臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取 觀察組均于急性期（第1～7天）、亞急性期（第8～14天）和恢復(fù)期（≥15 d）收集血液標(biāo)本。按照TRIzol?試劑說明書的步驟，將TRIzol試劑和血清以3∶1的體積比混合，置于冰沙中，依法提取出標(biāo)本中的總RNA，通過紫外分光光度計(jì)法測定總RNA的純度和濃度，以及凝膠電泳法鑒定RNA的完整性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需參照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。結(jié)束后立即1μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物由上海生工合成，hsa-miR-199a-5p[6]序列：正鏈5’-TTCACTCCCATCAGTGTCAGCT-3’，負(fù)鏈5’-CGTGCTTGTACTCC AGTCTCA-3；內(nèi)參U6序列：正鏈5’-TGGCAGGACATACTAAAA-3’，負(fù)鏈5’-CGTGCTTCACGATTGCGTGTA-3’。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，94℃變性14 s，61℃退火延伸58 s，共42個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。hsamiR-199a-5p的PCR產(chǎn)物長度為262 bp。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。為減小因RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，將3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt公式進(jìn)行分析[7]，計(jì)算公式為：△Ct值=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)－△Ct對照。用計(jì)算得到的值判定標(biāo)本中目的miRNA的表達(dá)量的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）的方式表達(dá)，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；線性相關(guān)性研究采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-199a-5p表達(dá)情況

qPCR結(jié)果顯示，觀察組的hsa-miR-199a-5p表達(dá)高于對照組（t=2.163，P＜0.05），且觀察組在急性期、亞急性期和恢復(fù)期時(shí)hsa-miR-199a-5p的表達(dá)表現(xiàn)出降低趨勢（F=－1.045，P＜0.05），見圖1。

圖1 hsa-miR-199a-5p在各組血液標(biāo)本中的表達(dá)

2.2 hsa-miR-199a-5p的表達(dá)與研究人群的臨床特征的相關(guān)性分析

將2組臨床特征比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)與hsa-miR-199a-5p的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，hsa-miR-199a-5p的表達(dá)僅與觀察組血清CRP水平呈顯著正相關(guān)（r=0.782，P＜0.05），見圖2。

圖2 觀察組血清hsa-miR-199a-5p的表達(dá)與CRP的相關(guān)性

2.3 血清hsa-miR-199a-5p表達(dá)診斷IS的價(jià)值

為了確定血清hsa-miR-199a-5p表達(dá)在IS診斷中的價(jià)值，參照Kobayashi[8]等的方法，采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）進(jìn)行預(yù)測，以2.31為界值，結(jié)果顯示，hsa-miR-199a-5p診斷IS的靈敏度為94.8%，特異度為96.2%，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.812（95%CI為0.613～0.919，P=0.003），適合作為診斷IS的標(biāo)志物，見圖3。

圖3 血清hsa-miR-199a-5p表達(dá)對IS的診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討論

隨著我國進(jìn)入老齡化社會，IS的發(fā)病率每年以8.0%左右的速度上升，已成為我國突出的一個(gè)公共衛(wèi)生問題[9]。目前，越來越多研究顯示IS是一種受遺傳及環(huán)境共同影響的多基因、多因素的慢性疾病，尤其與基因表達(dá)相關(guān)的小分子調(diào)控因子——miRNA的表達(dá)密切相關(guān)，如 Qu等[10]報(bào)告 miRNA(MIR)-146a rs2910164的單核苷酸多態(tài)性在缺血性腦卒中發(fā)病過程中高表達(dá)；又如Liu等[11]證實(shí)miRNA-SNP rs3735590會影響基因的表達(dá)，其高表達(dá)與IS和亞臨床動脈粥樣硬化密切相關(guān)。研究表明miRNA有望成為一種新的IS疾病分子標(biāo)志物。miRNA作為細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)因子，它可以在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上影響功能基因的表達(dá)豐度，據(jù)推測人類基因組中有約1/3的基因受miRNA調(diào)控[12]。通過檢測IS患者外周血液中的miRNA上的多態(tài)性位點(diǎn)的變化來監(jiān)測疾病的發(fā)展過程，可能會給IS的治療提供一種新的手段。

miR-199a位于在人染色體19q13.2，由Lagos[13]等于2003年首先從小鼠細(xì)胞中克隆獲得。Dai等[14]、Wu等[15]、Jones等[16]研究表明miR-199a與炎癥相關(guān)，其啟動子區(qū)存在多個(gè)MAPK和NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控IL-8、IL-10、IL-6、TGF-β等炎癥因子釋放，而IS疾病發(fā)展過程中會引起腦神經(jīng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，與miR-199a的表達(dá)密切相關(guān)，如Selvamani等[17]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)在缺血性腦卒中大鼠模型中存在miR-199a高度表達(dá)。hsamiR-199a-5p作為miR-199a經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工得到的成熟miRNA，最新研究顯示hsa-miR-199a-5p可能參與顱內(nèi)動脈血管壁的破裂[18]。本研究中，hsamiR-199a-5p在IS患者中的表達(dá)顯著高于健康人群（P＜0.05），并且IS患者在疾病的急性期、亞急性期和恢復(fù)期時(shí)hsa-miR-199a-5p的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的降低趨勢（P＜0.05），結(jié)果表明hsa-miR-199a-5p表達(dá)會增加IS的患病風(fēng)險(xiǎn)。與此同時(shí)，ROC預(yù)測結(jié)果顯示hsa-miR-199a-5p診斷IS的靈敏度為94.8%，特異度為96.2%，提示將檢測hsa-miR-199a-5p表達(dá)應(yīng)用于IS的診斷具有更小的誤診率和漏診率。此外，本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-199a-5p的表達(dá)與IS患者血清CRP水平呈顯著正相關(guān)（r=0.782，P＜0.05），究其原因可能與hsa-miR-199a-5p是一個(gè)炎癥相關(guān)基因，其表達(dá)升高引起腦部神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而刺激機(jī)體釋放大量的CRP。

本研究結(jié)果證實(shí)hsa-miR-199a-5p可以作為IS早期診斷的生物標(biāo)志物，通過檢測其表達(dá)的變化不僅有助于病情的評估，而且可為開展隊(duì)列研究、病因診斷和治療手段等研究提供初步的理論依據(jù)。

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（本文編輯：王晶）

Expression of hsa-miR-199a-5p in Ischemic Stroke Patients

HUI Su-yan.
Department of Rehabilitation,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China

Objective:To study the expression of hsa-miR-199a-5p in patients with ischemic stroke(IS).Methods:The serums of 118 IS patients and 125 healthy people at our hospital were enrolled.The expression of hsamiR-199a-5p was detected by real-time quantitative PCR(qPCR).The sensitivity and the specificity were evaluated by the receiver-operating characteristic(ROC)curve and relationship between the expression level of hsamiR-199a-5p and clinical features was analyzed,respectively.Results:The expression of hsa-miR-199a-5p in the IS patients was significantly higher than that in the healthy control(P＜0.05).The expression levels of hsamiR-199a-5p in serum varied at different stages in the IS patients with the lowest expression at the recover stage and highest expression at the acute stage(P＜0.05).Spearman correlation analysis showed that there was a positive correlation between hsa-miR-199a-5p expression and the serum CRP levels(r=0.782,P＜0.05).ROC predictions showed that the sensitivity and specificity of hsa-miR-199a-5p confirmed IS were 94.8%and 96.2%,and area under curve(AUC)was 0.812(95%CI0.613～0.919,P=0.003).Conclusion:Hsa-miR-199a-5p may be used as diagnostic biomarker in IS.

hsa-miR-199a-5p;ischemic stroke;expression;significance

R741;R743.3

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.004

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)科呼和浩特 010059

2016-09-29

惠素艷vnp257@163.com