劉蓓一　丁成龍　喬偉艷　李健　許能祥　潘孝青　秦楓　張霞　顧洪如

摘要：為了探討稻草與黑麥草混合青貯發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化規(guī)律，以稻草、黑麥草為青貯原料，從青貯后1、5、12、21、31、61、99、154 d的稻草、黑麥草混合青貯樣中取樣，分別測定pH值，采用培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)量的變化，使用PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)分析青貯過程中菌群組成多樣性。結(jié)果表明：黑麥草與稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，乳酸菌數(shù)量在5d達(dá)到最高峰，然后逐漸下降，酵母菌數(shù)量呈先降后升再降等波動變化，稻草與黑麥草混合青貯過程中優(yōu)勢菌主要有植物乳桿菌（Lactoacillus plantarum）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、食竇魏斯氏菌（W. cibaria）、短乳桿菌（L.brevis），且隨著青貯時(shí)間延長，優(yōu)勢菌數(shù)量下降。由結(jié)果可知，將DGGE和16S rRNA序列分析技術(shù)結(jié)合，能有效地研究青貯細(xì)菌的遺傳多樣性和組成的變化。

關(guān)鍵詞：青貯；微生物培養(yǎng)；動態(tài)變化；PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0123-04[HS）][HT9.SS]

秸稈的飼料化利用，是其資源化利用的有效途徑之一，也是促進(jìn)農(nóng)區(qū)草食動物發(fā)展的重要措施。我國農(nóng)作物秸稈總量達(dá)52 056萬t以上，其中稻草21 129萬t[1]。稻草與其他禾本科牧草青貯原料相比，干物質(zhì)含量高，但莖葉上自然附著的乳酸菌數(shù)量少，可溶性碳水化合物含量低[2]，所以常規(guī)青貯很難調(diào)制出高品質(zhì)的青貯料。多花黑麥草具有可溶性碳水化合物含量高、纖維素和木質(zhì)素含量低的優(yōu)點(diǎn)，但其含水量高，直接青貯容易產(chǎn)生大量的滲出液，導(dǎo)致青貯飼料酸度大，從而降低青貯飼料的營養(yǎng)成分[3]。水稻秸稈和黑麥草混合青貯，不僅能解決稻草可溶性碳水化合物含量低、青貯不易成功的問題，還能解決黑麥草水分含量高、不易青貯的問題。李君臨等指出，黑麥草單獨(dú)青貯不易成功，與水稻秸稈按7 ∶[KG-*3]3混合青貯時(shí)發(fā)酵品質(zhì)最佳，顯著降低了氨態(tài)氮占總氮的比例以及乙酸、丙酸和丁酸的含量[4]。青貯飼料是個(gè)復(fù)雜的微生物共生體系，主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌及其他腐敗細(xì)菌[5]，而青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣直接取決于乳酸菌的增殖與變化。在發(fā)酵初期，乳酸菌開始增殖，隨著pH值的逐漸下降和厭氧程度的加強(qiáng)，乳酸菌在數(shù)量上逐漸形成絕對優(yōu)勢，其他微生物的生長受到抑制，乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸，使pH值進(jìn)一步下降，其他微生物的活性進(jìn)一步減弱，當(dāng)pH值下降到一定程度以后，乳桿菌的活性也受到了抑制[6]。可見，青貯過程中微生物數(shù)量及種群的動態(tài)變化研究十分重要。包慧芳等指出，玉米秸稈青貯飼料發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌主要有植物乳桿菌（Lactoacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），且采用菌劑處理后青貯玉米pH值下降更快，其優(yōu)勢細(xì)菌種類更豐富[7]。詹發(fā)強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬、片球菌屬是青貯玉米發(fā)酵的啟動菌之一，在發(fā)酵前期一直存在，但在發(fā)酵后期，乳桿菌屬是玉米青貯過程中乳酸菌的主要菌群[8]。楊云貴等指出，在玉米青貯過程中，主要微生物隨著青貯時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐步減少的趨勢，而乳酸菌在青貯第6、7天數(shù)量最高，之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢[9]。目前，有關(guān)黑麥草與稻草混合青貯發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化規(guī)律沒有相關(guān)報(bào)道。

本研究通過跟蹤微生物數(shù)量在稻草與黑麥草混合青貯過程中的變化情況，以及利用PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）方法對稻草與黑麥草混合青貯中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，從而了解青貯發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化規(guī)律，以期為青貯微生物研究及復(fù)合型添加劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1青貯的制作與采樣

將新鮮的多花黑麥草、水稻秸稈切短至2～3 cm，按多花黑麥草 ∶[KG-*3]水稻秸稈質(zhì)量比=7 ∶[KG-*3]3進(jìn)行混貯，用聚酯乙烯（52 cm×38 cm）青貯，每袋裝至半袋（約500 g），沒有加入添加劑，用真空封口機(jī)封口。分別于青貯后1、5、12、21、31、61、99、154 d開袋取樣。

1.2青貯pH值測定

稱取25 g樣品，加入200 mL三角瓶中，加入700 mL蒸餾水后置于4 ℃冰箱內(nèi)浸提24 h。然后通過2層紗布和濾紙過濾，測定濾液pH值。

1.3菌株分離培養(yǎng)方法

稱取樣品10 g放入已滅菌的小三角瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min搖2 h。用1層無菌紗布過濾青貯草渣，然后逐級稀釋，接種10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋梯度的懸浮液于MRS培養(yǎng)基（CM036，Oxoid）上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，計(jì)算乳酸菌數(shù)量。將梯度稀釋的懸浮液接種于葡萄糖麥芽浸膏培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算酵母菌數(shù)量。將梯度稀釋的懸浮液接種于馬鈴薯培養(yǎng)基（CM0139，Oxoid）上，30 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算霉菌數(shù)量。

選取MRS培養(yǎng)基上光滑、圓形、灰白色菌落進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)；選取葡萄糖麥芽浸膏培養(yǎng)基上大而厚、濕潤、表面光滑、多數(shù)不透明、黏稠、菌落顏色單調(diào)的菌落進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)；選取馬鈴薯培養(yǎng)基上菌絲細(xì)長，菌落疏松，呈絨毛狀、蛛蛛網(wǎng)狀、棉絮狀菌落進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。對菌落數(shù)在10～100個(gè)的培養(yǎng)皿進(jìn)行有效性計(jì)數(shù)：

[JZ]樣品中活菌數(shù)A=N×D/m。

式中：N為菌落數(shù)，個(gè)；D為稀釋倍數(shù)；m為取樣量，g。

1.4青貯飼料菌群總DNA提取

取青貯飼料樣10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min搖2 h。用1層無菌紗布過濾青貯草渣，8 000 g 離心15 min收集細(xì)菌菌體，然后按照DNeasy Tissue Kit（Qiagen，USA）說明書提取青貯飼料菌群的總DNA。

1.516S rDNA V3區(qū)域的PCR擴(kuò)增

以純化后的基因組DNA為PCR反應(yīng)的模版，擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)的基因，引物參照Muyzer，引物序列：F338，5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518，5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增片段為200 bp。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 μmol/L引物，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA酶，加ddH2O至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.6DGGE分析

參照Muyzer等的方法[10]，將16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離。變性劑濃度范圍為45%～60%，變性梯度方向與電泳方向一致。電泳采用D-code DGGE系統(tǒng)（Bio-Rad），電泳緩沖液為1×TAE，240 V電壓預(yù)電泳30 min，在恒溫60 ℃下的1×TAE緩沖液中進(jìn)行，80 V電泳15 h，電泳結(jié)束后用AgNO3染色，顯色定影后用Vilber凝膠成像掃描系統(tǒng)照像。凝膠拍照成像后，用滅菌刀片切下含目的條帶的凝膠塊，將凝膠塊轉(zhuǎn)移至微量離心管中，用槍頭將膠塊搗碎，加入 50 μL ddH2O，98 ℃煮沸 10 min 后于4 ℃過夜。在進(jìn)行第2次PCR前，于 12 000 r/min 離心5 min以上，吸取上清作為模板。

采用16S rRNA片段V3區(qū)引物（不帶“GC”夾板）的F338、R518對DGGE膠上切下的目的條帶進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系、反應(yīng)條件同“1.5”節(jié)。用1.0%瓊脂糖電泳檢測產(chǎn)物，用Axygen膠回收試劑盒回收目的條帶。膠回收產(chǎn)物經(jīng)pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇具有氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子，采用T載體通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7序列分析

采用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的BLAST程序（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1青貯過程中pH值及微生物數(shù)量的變化過程

從表1可以看出，隨著青貯時(shí)間的延長，黑麥草與稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，在青貯5 d時(shí)pH值降為4.76，12 d時(shí)pH值降為4.45，青貯12 d以后pH值下降緩慢；青貯乳酸菌數(shù)量在5 d達(dá)到最高峰，為9.50×107個(gè)/g，然后逐漸下降，到21 d時(shí)乳酸菌數(shù)量為8.50×106個(gè)/g，到 154 d 時(shí)乳酸菌數(shù)量只有5 200個(gè)/g；隨著青貯時(shí)間的延長，酵母菌數(shù)量先降低，青貯后1 d酵母菌數(shù)量最高，達(dá)7.45×105個(gè)/g，到61 d時(shí)酵母菌數(shù)量最少，<100個(gè)/g；隨著青貯時(shí)間的延長，霉菌數(shù)量迅速減少，直到青貯 5 d，霉菌數(shù)量小于100個(gè)/g。

2.2青貯細(xì)菌樣品DGGE分析

從圖1可以看出，青貯1 d時(shí)多樣性最豐富；條帶2在青貯后1 d存在，青貯5 d后該條帶消失；條帶3、4、8、9在青貯1至99 d持續(xù)存在，但隨著青貯時(shí)間的延長，亮度減弱；條帶5、6、7從青貯1至61 d持續(xù)存在；條帶10存在于青貯12～ 61 d；條帶11、12、13僅存在于青貯61 d；條帶14、15、16、17僅存在于青貯154 d；條帶18僅出現(xiàn)在青貯99 d。

回收上述優(yōu)勢條帶和變化較明顯的條帶進(jìn)行測序分析。由表2可知，條帶2為植物乳桿菌（L.plantarum）；條帶3、4、8、9分別為植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、Uncultured bacterium、Uncultured Weissella；條帶5、6、7分別為類腸膜魏斯氏菌、食竇魏斯氏菌（W. cibaria）、植物乳桿菌；條帶10為短乳桿菌（L.brevis）；條帶11、12、13分別為Uncultured Lactobacillus、植物乳桿菌、米酒乳桿菌（L.sake）；條帶14、15、16分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；條帶17、18分別為阿耶波多桿菌（B. aryabhattai）、寡氧單胞菌（Stenotrophomones acidaminiphila）。

DGGE條帶的亮度高低代表菌所占數(shù)量的多少。由表1可知，青貯1 d時(shí)乳酸菌數(shù)量占比較高。由圖1可見，條帶3（L.plantarum）、條帶4（W. paramesenteroides）在青貯5 d時(shí)數(shù)量達(dá)到最大值；隨著青貯時(shí)間延長，條帶3、4的亮度降低，即L.plantarum與W. paramesenteroides隨著青貯時(shí)間延長，數(shù)量占比下降；到154 d時(shí)，條帶3、4很暗，主要菌群是B. licheniformis、B. aryabhattai，這與培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)乳酸菌的結(jié)果一致，到青貯154 d時(shí)，乳酸菌的數(shù)量僅為5 200個(gè)/g（表1）。可以看出，稻草與黑麥草混合青貯過程中優(yōu)勢菌主要有L.plantarum、Weissella paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis，故進(jìn)行菌劑配伍改良時(shí)，可適當(dāng)提高這4種菌的比例。

3討論

3.1稻草與黑麥草混合青貯過程中pH值、乳酸菌的變化

pH值的高低是青貯飼料質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，質(zhì)量良好的青貯要求pH值<4.5。在本試驗(yàn)中，隨著青貯時(shí)間的延長，黑麥草、稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，在青貯5 d時(shí)pH值降為4.76，12 d時(shí)pH值降為4.45，青貯12 d以后pH值下降緩慢，61 d時(shí)pH值為4.21，說明青貯質(zhì)量良好。與玉米青貯相比，黑麥草、稻草混合青貯pH值下降沒有玉米青貯快。楊云貴等指出，玉米青貯的pH值在青貯2 d就能下降到4以下，然后穩(wěn)定在3.5左右，且全株玉米青貯pH值低于秸稈玉米青貯[9]。即與玉米青貯相比，黑麥草、稻草混合青貯pH值下降沒有玉米青貯快，可能是因?yàn)榇嗽囼?yàn)中黑麥草與水稻秸稈是以質(zhì)量比7 ∶[KG-*3]3混貯的，水稻秸稈含量比較高，而水稻秸稈可溶性碳水化合物含量低，導(dǎo)致本試驗(yàn)中pH值下降沒有玉米青貯快。

青貯中乳酸菌是起主要作用的益生菌，它們在厭氧狀態(tài)下將原料中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸。本試驗(yàn)中青貯乳酸菌數(shù)量在5 d達(dá)到最高峰，為9.50×107個(gè)/g，然后逐漸下降，61 d 時(shí)維持在106數(shù)量級。此結(jié)果與楊云貴等試驗(yàn)中玉米青貯過程中乳酸菌數(shù)量變化結(jié)果的趨勢[9]相似。但Li等指出，凋萎多花黑麥草青貯過程中乳酸菌數(shù)量是先增加，到第7天時(shí)最大，隨后降低，然后又增加、降低，而凋萎的羊草青貯過程中乳酸菌數(shù)量在第3天時(shí)已經(jīng)達(dá)到最高峰，隨著青貯時(shí)間的增加，乳酸菌數(shù)量變化得比較小[11]。

3.2稻草與黑麥草混合青貯過程中菌群的演替規(guī)律

從DGGE電泳結(jié)果可以看出，青貯1 d時(shí)多樣性最豐富，青貯過程中，細(xì)菌種類經(jīng)歷了由多到少的變化且種類也發(fā)生了變化。韓吉雨等認(rèn)為，玉米發(fā)酵過程中細(xì)菌種類只經(jīng)歷了由多到少的過程，而苜蓿青貯過程中細(xì)菌種類沒有發(fā)生太大的變化[12]。這可能是由于物料的內(nèi)部及外部結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。

稻草與黑麥草混合青貯過程中優(yōu)勢菌主要有L.plantarum、W. paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis。L.plantarum是同型乳酸菌[13]，是農(nóng)作物青貯發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌[14]。Ennahar等指出，L.plantarum是水稻青貯的主要優(yōu)勢菌[15]。W. Paramesenteroides是傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中的優(yōu)勢乳酸菌之一[16]。W. Paramesenteroides、L.brevis也是水稻秸稈發(fā)酵全混合日糧（TMR）和玉米秸稈發(fā)酵TMR中的優(yōu)勢乳酸菌[17]。W. Cibaria是水稻青貯中的優(yōu)勢菌，Pang等研究表明，水稻青貯的主要菌群是W.cibaria、W.confusa、L.lactis subsp.lactis和L.plantarum[18]。L.brevis是玉米秸稈的主要優(yōu)勢菌，占 23.7%[19]。而玉米秸稈青貯過程中主要的優(yōu)勢菌是Lactoacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactococcus lactis[7]。劉建新認(rèn)為，青貯起始階段，大腸桿菌大量增殖，直到第3天數(shù)量減少，被乳球菌（腸球菌、明串球菌、片球菌、四聯(lián)球菌）代替，然后又被生長較慢、產(chǎn)酸較多的乳桿菌代替[20-21]。這與本試驗(yàn)過程中L.brevis出現(xiàn)在青貯12～61 d及L.sake僅出現(xiàn)在青貯61 d的結(jié)果是一致的。但是本試驗(yàn)在整個(gè)青貯過程中沒有發(fā)現(xiàn)有乳球菌的存在。McEniry等研究發(fā)現(xiàn)，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、明串珠菌（Leuconostoc carnosum）是青貯第2、6天的主要優(yōu)勢菌群[22]。Langston等也指出，在青貯早期存在明串珠菌屬（Leuconostoc）菌[23]。但Li等指出，水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）是多花黑麥草凋萎整個(gè)青貯過程中都存在的優(yōu)勢菌，Enterococcus faecium僅存在于青貯第7、28天，而青貯第120天時(shí)出現(xiàn)Pediococcus pentosaceus、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）這2種新的菌[11]。這可能是由于青貯本身材料的不同或添加乳酸菌等添加劑造成的青貯過程中菌群多樣性的不同。李雁冰等的研究[24]也證實(shí)了這一點(diǎn)。

4結(jié)論

將DGGE、16S rRNA序列分析技術(shù)結(jié)合，能夠非常有效地研究稻草與黑麥草混合青貯細(xì)菌的遺傳多樣性和組成的變化，進(jìn)一步將其與發(fā)酵特性、傳統(tǒng)培養(yǎng)等研究手段一起應(yīng)該能更好地揭示青貯微生物的功能。

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