薛科科 李映 李朋鈺

摘要[目的]探討小檗堿與綠僵菌復(fù)配的可能性。[方法]考察小檗堿對(duì)綠僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響，并測(cè)定小檗堿與綠僵菌復(fù)配對(duì)桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）的抑制作用。[結(jié)果]試驗(yàn)濃度的小檗堿對(duì)綠僵菌的孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量和菌落形成未產(chǎn)生明顯影響；當(dāng)綠僵菌與褐腐病菌共培養(yǎng)時(shí)，綠僵菌處于優(yōu)勢(shì)菌群，褐腐病菌未能影響綠僵菌的生長(zhǎng)；小檗堿與綠僵菌復(fù)配能完全抑制褐腐病菌的生長(zhǎng)。[結(jié)論]小檗堿和綠僵菌可混合使用，二者相容性好。

關(guān)鍵詞 小檗堿；綠僵菌；桃褐腐病菌；相容性；防治

中圖分類號(hào) S48 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）03-0178-04

Abstract[Objective] The aim was to explore the compatibility of berberine （BBR） with Metarhizium anisopliae.[Method] We investigated influences of BBR on spore germination，hyphal growth and sporulation of M.anisopliae，and examined the inhibition of BBRM.anisopliae complex on Monilinia fructicola，a major brown rot pathogen.[Result] The BBR had no significant effect on conidial germination，spore number and mycelial growth of M.anisopliae.Furthermore，M.anisopliae was the predominant species when cocultured with M.fructicola，and M.fructicola failed to retard the growth of M.anisopliae.[Conclusion]M.fructicola could be totally inhibited by the “mixture” of BBR and M.anisopliae.

Key words Berberine；Metarhizium anisopliae；Monilinia fructicola；Compatibility；Prevention

農(nóng)藥殘留嚴(yán)重危害人體健康，生物農(nóng)藥安全環(huán)保，如何減少農(nóng)藥使用量是農(nóng)藥減量和食品安全的重點(diǎn)研究方向。小檗堿作為傳統(tǒng)抗菌藥物，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌有效，臨床主要用于治療腸炎，研究證明小檗堿還具明顯的抗癌、治療糖尿病、抗高血壓、治療心律失常等新功能[1]。小檗堿主要存在于黃連、黃柏、三顆針、十大功勞等中藥中，該類中藥資源豐富，小檗堿市場(chǎng)價(jià)格低廉，決定了其作為農(nóng)用殺菌劑的成本優(yōu)勢(shì)。小檗堿作為農(nóng)用殺菌劑，對(duì)作物灰霉病、白粉病、褐腐病、晚疫病等防效較高[2]。

綠僵菌（Metarhizium anisopliae）作為重要的抗昆蟲(chóng)病原真菌，具有生產(chǎn)容易、無(wú)殘留、持效期長(zhǎng)、致病力強(qiáng)、對(duì)非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多種作物害蟲(chóng)有寄生致死作用，自20世紀(jì)60 年代至今，已有50多種綠僵菌制劑注冊(cè)登記[3]。但綠僵菌殺蟲(chóng)速度慢和成本較高的缺點(diǎn)限制了其大面積推廣應(yīng)用。

殺蟲(chóng)劑與殺菌劑混合使用將節(jié)省人力、物力，減少農(nóng)藥使用次數(shù)，同時(shí)提高防效、降低成本，保障食品安全。文獻(xiàn)報(bào)道，部分化學(xué)殺菌劑，如多菌靈、代森錳鋅和甲基硫菌靈對(duì)綠僵菌毒性大，與綠僵菌相容性差[4]。筆者所在課題組前期研究證明，小檗堿對(duì)桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）防效好[5]，綠僵菌對(duì)多種害蟲(chóng)有防治作用[3]?；诖?，筆者研究了小檗堿對(duì)綠僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響，以及二者配伍對(duì)褐腐病菌的抑制作用，以期為評(píng)價(jià)小檗堿與綠僵菌聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

80億孢子/g綠僵菌可濕性粉劑由重慶聚立信生物工程有限公司提供，黃連（Coptis chinensis Franch）中藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店，桃褐腐病菌由北京市農(nóng)林科學(xué)院李興紅研究員惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 小檗堿提取。黃連粉碎，水浸泡，調(diào)pH 5.0，加纖維素酶和果膠酶，40～42 ℃酶解6 h，70%乙醇提取1.5 h，提取液用濃鹽酸調(diào)pH 1.5，再加入20% NaCl溶液，攪拌均勻，冰箱隔夜冷藏，產(chǎn)物析出，重結(jié)晶得小檗堿，HPLC檢測(cè)小檗堿含量為97%。

1.2.2 綠僵菌純化及孢子懸液制備。

制備PDA培養(yǎng)基，用解剖針蘸取綠僵菌孢子至平板，28 ℃培養(yǎng)，3 d后用0.6% Tween-80水溶液洗孢子，涂布至新培養(yǎng)基，得純化綠僵菌。將綠僵菌孢子逐步稀釋，顯微鏡下觀察，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子含量，將孢子調(diào)至試驗(yàn)所需濃度。

1.2.3 小檗堿抑制桃褐腐病菌EC50測(cè)定。以PDA培養(yǎng)基活化桃褐腐病菌，配制不同濃度小檗堿（0、1.500、3.000、6.000、12.000、24.000 μg/mL）的含藥培養(yǎng)基，每濃度3次重復(fù)。用打孔器取直徑8 mm的褐腐病菌菌餅，菌絲朝下置于培養(yǎng)基中心，28 ℃培養(yǎng)。7 d后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑制率和小檗堿EC50[6]。

菌落直徑=測(cè)量菌落直徑平均值-8

小檗堿對(duì)桃褐腐病菌的抑制率=（空白對(duì)照組菌落直徑-帶藥組菌落直徑）/空白對(duì)照組菌落直徑×100%

1.2.4 小檗堿對(duì)綠僵菌的作用研究。

1.2.4.1 小檗堿對(duì)綠僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響。配制含小檗堿EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）的PDA培養(yǎng)基，以不加小檗堿的平板為對(duì)照，每濃度重復(fù) 5次。取綠僵菌菌餅（直徑8 mm），置于含小檗堿培養(yǎng)基中央（菌絲朝下），28 ℃培養(yǎng) 36 h，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.2.4.2 小檗堿對(duì)綠僵菌孢子萌發(fā)的影響。取1 000孢子/mL孢懸液100 μL，接種于“1.2.4.1”含藥培養(yǎng)基，涂布均勻，以不加小檗堿的平板為對(duì)照，每濃度重復(fù)5次。25 ℃培養(yǎng) 24 h，顯微鏡下觀察孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)數(shù)。

孢子萌發(fā)抑制率=（1-處理菌落數(shù)/對(duì)照菌落數(shù)）×100%

1.2.4.3 小檗堿對(duì)綠僵菌產(chǎn)孢量的影響。在無(wú)菌條件下，于“1.2.4.1”菌落半徑的 1/2 處，用內(nèi)徑 8 mm 的滅菌打孔器打孔取樣，每菌落以“十”字形取 4 個(gè)點(diǎn)，置于裝有玻璃珠、含0.6% Tween-80水溶液，充分振蕩均勻，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢抑制率。

產(chǎn)孢抑制率=（1-處理產(chǎn)孢量/對(duì)照產(chǎn)孢量）×100%

1.2.5 綠僵菌與褐腐病菌間的相互作用研究。

1.2.5.1 綠僵菌對(duì)褐腐病菌的作用。將桃褐腐病菌接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)6 d，用0.6% Tween-80水溶液配制桃褐腐病菌孢子懸浮液，濃度為1×105孢子/mL，取3 mL孢子液涂布于培養(yǎng)基，取綠僵菌菌餅（8 mm）置于平板中央，倒置，28 ℃培養(yǎng)36 h，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.5.2 褐腐病菌對(duì)綠僵菌的作用。制備PDA培養(yǎng)基平板，待培養(yǎng)基溫度降至45 ℃時(shí)，取1×105孢子/mL綠僵菌孢子懸浮液置于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基凝固時(shí)將褐腐病菌餅置于平板中央，28 ℃培養(yǎng)36 h，觀察并記錄褐腐病菌生長(zhǎng)情況。

1.2.6 小檗堿和綠僵菌復(fù)配對(duì)褐腐病菌的抑制作用研究。

根據(jù)等效線法按表1制備含小檗堿 （EC50濃度為3.600 μg/mL，以a表示）和綠僵菌 （濃度為1×105孢子/mL，以b表示）的PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固時(shí)將褐腐病菌餅置于平板中央，28 ℃培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每濃度3次重復(fù)。采用共度系數(shù)法計(jì)算共毒因子[7]。計(jì)算復(fù)配農(nóng)藥抑制率，以共毒因子作為復(fù)配農(nóng)藥藥效增效標(biāo)準(zhǔn)。若共毒因子大于20，則表示兩藥之間有協(xié)同作用；若共毒系數(shù)小于-20，則表示兩藥之間有拮抗作用；若共毒因子為-20～20，則表示兩藥之間作用相加。

混劑理論抑制率=小檗堿理論抑制率+綠僵菌理論抑制率

共毒因子=[（混劑實(shí)際抑制率-混劑理論抑制率）/混劑理論抑制率]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿抗桃褐腐病菌EC50測(cè)定 由表2和圖1可知，隨濃度增加，小檗堿對(duì)褐腐病菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)小檗堿濃度為24.000 μg/mL時(shí)，菌落直徑為3.67 mm，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得小檗堿EC50為3.599 μg/mL，與Hou等[6]的試驗(yàn)結(jié)果（EC50=4.550 μg/mL）基本一致，表明小檗堿抑制褐腐病菌效果穩(wěn)定。

2.2 小檗堿對(duì)綠僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基添加小檗堿濃度為EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）時(shí)，綠僵菌生長(zhǎng)均較快，接種第2天，小檗堿即長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，表明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)綠僵菌為優(yōu)勢(shì)菌，小檗堿對(duì)綠僵菌無(wú)抑制作用。這表明，小檗堿在100倍EC50的高濃度時(shí)對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)未產(chǎn)生影響，小檗堿防治桃褐腐病的田間使用濃度為0.125‰[5]，二者濃度相差28.8倍，故小檗堿和綠僵菌可復(fù)配使用。

2.3 小檗堿對(duì)綠僵菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基含小檗堿濃度為EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）時(shí)對(duì)綠僵菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)均無(wú)抑制作用（表3）?？梢?jiàn)，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)小檗堿對(duì)綠僵菌分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)是安全的。

2.4 綠僵菌與褐腐病菌之間的抑制作用

由圖3可知，當(dāng)綠僵菌為優(yōu)勢(shì)菌種時(shí)，完全抑制褐腐病菌的生長(zhǎng)；以褐腐病菌為優(yōu)勢(shì)菌種時(shí)，褐腐病菌不生長(zhǎng)?？傊?，綠僵菌與桃褐腐病菌共培養(yǎng)時(shí)，綠僵菌均能很快成為優(yōu)勢(shì)菌種，說(shuō)明綠僵菌可抑制褐腐病菌生長(zhǎng)。

2.5 小檗堿與綠僵菌復(fù)配對(duì)褐腐病菌的抑制作用

將不同濃度小檗堿與綠僵菌復(fù)配，制備含藥培養(yǎng)基。結(jié)果表明，不同配比的含藥培養(yǎng)基對(duì)桃褐腐病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，小檗堿與綠僵菌復(fù)配，在5/6a+1/6b、2/3a+1/3b、1/2a+1/2b、1/3a+2/3b、1/6a+5/6b范圍內(nèi)可完全抑制褐腐病菌（圖4）。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)考察了小檗堿對(duì)綠僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢和菌落的影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)濃度的小檗堿對(duì)綠僵菌的孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量和菌落形成未產(chǎn)生明顯影響；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綠僵菌與褐腐病菌共同培養(yǎng)時(shí)，綠僵菌始終是優(yōu)勢(shì)菌群，褐腐病菌不能影響綠僵菌的生長(zhǎng)；當(dāng)小檗堿與綠僵菌按一定比例復(fù)配時(shí)能完全抑制褐腐病菌的生長(zhǎng)。國(guó)外登記的綠僵菌防治對(duì)象中，綠僵菌的靶標(biāo)害蟲(chóng)分屬12目33科，其中同翅目沫蟬科、蚜科、飛虱科、粉虱科和蟬科的害蟲(chóng)對(duì)作物危害嚴(yán)重[8]。作物生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭受病蟲(chóng)害的危害，因此，防病和防蟲(chóng)需同時(shí)進(jìn)行，為節(jié)省人力、物力，減少農(nóng)藥使用次數(shù)，小檗堿和綠僵菌可混合使用，二者相容性好。鑒于小檗堿原料易得、價(jià)格低廉、使用方便，小檗堿與綠僵菌配比宜調(diào)整為1∶1～5∶1，研究結(jié)果為評(píng)價(jià)小檗堿與綠僵菌聯(lián)合應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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