韓曉磊，顧 益，徐棉棉，沙永良，徐建榮，韓曜平

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.太倉市西湖川水產(chǎn)專業(yè)合作社，江蘇 太倉 215400）

太湖流域中華鱉不同群體線粒體基因序列比較分析

韓曉磊1，顧 益2，徐棉棉1，沙永良2，徐建榮1，韓曜平1

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.太倉市西湖川水產(chǎn)專業(yè)合作社，江蘇 太倉 215400）

通過PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)對太湖流域的中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的部分線粒體基因序列，包括16S rRNA、12S rRNA、細(xì)胞色素b（Cytb）和D-loop區(qū)進(jìn)行比對分析研究. 結(jié)果顯示：中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的16S rRNA、12S rRNA、Cytb和D-loop區(qū)部分基因序列比對相似度和遺傳距離分別為97.33%，98.19%，97.34%，98.83%和0.023，0.026，0.026，0.022.結(jié)果表明：中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體親緣關(guān)系較近，沒有達(dá)到種間差異，但兩者已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化，達(dá)到亞種分化水平.

中華鱉；16S rRNA；12S rRNA；細(xì)胞色素b；D-loop區(qū)

線粒體DNA是共價閉合的雙鏈DNA分子，核酸組成和序列較保守，基因排列的順序穩(wěn)定而緊密，無單拷貝和重組. 由于線粒體DNA含有豐富的進(jìn)化信息，具有長度短、含量豐富、母性遺傳和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已成為研究動物遺傳分化及起源進(jìn)化的理想手段［1-5］. 中華鱉（Pelodiscus sinensis），隸屬于爬行綱（Reptilia）、龜鱉目（Testudoformes）、鱉科（Trionychidae），俗稱甲魚、團(tuán)魚、王八等. 在我國，中華鱉分布廣泛，除西藏和青海外的其他各省均有發(fā)現(xiàn)，長江流域和華南地區(qū)分布較多，太湖流域產(chǎn)量歷年穩(wěn)居全國前列［6-7］. 中華鱉太湖群體除普通中華鱉群體，即太湖鱉群體之外，還存在中華鱉地方特色品種，即太湖花鱉群體，其主要生活在長江中下游，特別是太湖流域，因其背上有對稱的黑色小圓花點(diǎn)，野生環(huán)境中身體油綠，裙邊寬厚，腹部有灰黑色塊狀花斑，故此得名. 太湖花鱉較之太湖鱉具有野性足、生長快、色澤艷、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，并因其獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值深受消費(fèi)者喜愛，江浙地區(qū)養(yǎng)殖廣泛，市場前景良好.目前研究顯示，中華鱉還沒有明確的亞種分類，但卻存在著一些不同的地理群體，其中太湖花鱉的分類地位也沒有明確論斷［8］. 本文利用線粒體DNA測序技術(shù)對太湖流域中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，以判斷兩個群體是否有遺傳分化，為太湖流域中華鱉不同群體間的種質(zhì)鑒定和分類地位提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

中華鱉兩個群體樣品采集在2014年5—10月間，太湖花鱉群體取自太湖流域太倉地區(qū)（野生群體，圖1（a），太湖鱉群體取自太湖流域常州地區(qū)（野生群體，圖1（b）.取中華鱉腿部肌肉組織為材料于無水乙醇中-20 ℃保存?zhèn)溆?，太湖花鱉群體和太湖鱉群體分別取30尾和19尾進(jìn)行實(shí)驗，各群體將每個個體DNA進(jìn)行混合作為模板，以用于該群體的線粒體DNA序列分析.

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 DNA的提取

中華鱉基因組DNA的提取參照韓曉磊等［9］的方法. 用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定基因組DNA濃度，并通過瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，置-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 引物設(shè)計

圖1 太湖流域2個中華鱉群體形態(tài)示意圖

根據(jù)GenBank上中華鱉線粒體基因組序列（AY687385.1）分別設(shè)計用于擴(kuò)增16S rRNA、12S rRNA、Cytb和D-loop區(qū)基因的6組引物（見表1），送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成，用去離子雙蒸水將其溶解至濃度為10 μM.

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為25 μL，含模板基因組DNA100 ng，10×Buffer 2.5 μL，MgCl（22.5 mol/L）2.0 μL，dNTP 1.5 μL，上下游引物各1 μL，1U Taq DNA聚合酶，加無菌水補(bǔ)足. PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min；94%變性45 s，55.3 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后送至蘇州金唯智生物科技有限公司直接進(jìn)行序列測定，為保證序列的準(zhǔn)確性，序列經(jīng)過正反兩次重復(fù)測定.

1.2.4 序列比較和分析

所獲得的序列刪除引物序列再經(jīng)校對后，應(yīng)用DNAMAN 7.0軟件與GenBank下載的序列進(jìn)行序列排序并比對，生成供系統(tǒng)發(fā)生分析的矩陣. 利用MEGA 5.1軟件進(jìn)行序列分析，得出堿基組成、遺傳相似度、遺傳距離、變異位點(diǎn)和轉(zhuǎn)換/顛換值等.

表1 中華鱉線粒體DNA擴(kuò)增引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 16SrRNA基因序列分析

中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1676 bp和1680 bp，兩個群體的16S rRNA相似度為97.33%，遺傳距離為0.023；經(jīng)序列比對，兩序列共有35處堿基的差異，其中轉(zhuǎn)換18個，顛換6個，核苷酸的替換位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換為主，堿基轉(zhuǎn)換與顛換比為3.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚（見表2）；太湖花鱉群體16S rRNA堿基的缺失位點(diǎn)為5處，而太湖鱉群體為2處；太湖花鱉群體16S rRNA未測定的堿基數(shù)為3個，而太湖鱉群體為15個.

表2 太湖鱉群體和太湖花鱉群體不同基因序列分析

2.2 12S rRNA基因序列分析

中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的12S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為901 bp和900 bp，兩個群體的12S rRNA相似度為98.19%，遺傳距離為0.026；經(jīng)序列比對，太湖花鱉群體和太湖鱉群體共有16處堿基的差異，其中轉(zhuǎn)換12個，顛換3個，核苷酸的替換位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換為主，堿基轉(zhuǎn)換與顛換比為4.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚（見表2）；太湖花鱉群體12S rRNA堿基的缺失位點(diǎn)為1處，而太湖鱉群體為0處.

2.3 Cytb基因序列分析

中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體Cytb的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1201 bp和1200 bp，兩個群體的Cytb相似度為97.34%，遺傳距離為0.026；經(jīng)序列比對，太湖花鱉群體和太湖鱉群體共有32處堿基的差異，其中轉(zhuǎn)換26個，顛換5個，核苷酸的替換位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換為主，堿基轉(zhuǎn)換與顛換比為5.2，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚（見表2）；太湖花鱉群體Cytb堿基的缺失位點(diǎn)為0處，而太湖鱉群體為1處.

2.4 D-loop區(qū)基因序列分析

中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的D-loop區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為481 bp，兩個群體的D-loop區(qū)相似度為98.83%，遺傳距離為0.022；經(jīng)序列比對，太湖花鱉群體和太湖鱉群體兩序列共有6處堿基的差異，其中轉(zhuǎn)換5個，顛換1個，核苷酸的替換位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換為主，堿基轉(zhuǎn)換與顛換比為5.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏倚（見表2）；兩個群體D-loop區(qū)堿基的缺失位點(diǎn)均為0處.

3 討論

群體間的遺傳距離是衡量群體遺傳分化的重要指標(biāo)［10］. 根井正利［11］根據(jù)遺傳距離數(shù)值對物種不同分類單位間的遺傳分化水平做出定量估算，得出種群間遺傳距離值的范圍是0~0.05，亞種間是0.02~0.2. 本研究中，根據(jù)線粒體DNA的16S rRNA基因、12S rRNA基因、細(xì)胞色素b（Cytb）基因和D-loop區(qū)測序分析的中華鱉太湖花鱉群體和太湖鱉群體的群間遺傳距離分別為：0.023，0.026，0.026和0.022，均小于0.05且大于0.02，說明兩個群體之間親緣關(guān)系相對較近，還未達(dá)到種間差異，但兩者已經(jīng)產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，已經(jīng)達(dá)到亞種水平. 太湖花鱉群體和太湖鱉群體線粒體DNA的16S rRNA基因、12S rRNA基因、細(xì)胞色素b（Cytb）基因和D-loop區(qū)的基因序列比對相似度同樣也得出了以上結(jié)論. 太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，與中華鱉普通品種在形態(tài)上存在較大不同，本文研究中兩者遺傳分化程度雖然還沒有達(dá)到種間水平，但已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的遺傳趨異，可以認(rèn)為已經(jīng)分屬于不同的亞種群. 當(dāng)然，太湖流域中華鱉太湖花鱉群體與太湖鱉群體之間分類關(guān)系的確定，除了分子和形態(tài)方面的研究，還有賴于組織和細(xì)胞水平方面的研究予以論證.

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Abstract:In the present study, the variation and genetic diversity of mtDNA partial sequences including 16S rRNA, 12S rRNA, Cytb and D-loop region from Pelodiscus sinensis Taihu flower population and P. sinensis taihu population were analyzed. The results showed that genetic similarity between two different populations of P. sinensis in Taihu basin were 97.33%, 98.19%, 97.34% and 98.83%, respectively and that the genetic distances were 0.023, 0.026, 0.026 and 0.022, respectively. The results indicated a certain degree of genetic differentiation between the two populations of P. sinensis in Taihu basin, which achieved the subspecies level, though relatively similar, but not the speciation level.

Key words:Pelodiscus sinensis; 16S rRNA; 12S rRNA; Cytb; D-loop

A Comparative Analysis of Mitochondrial Genome Sequence from Different Populations of Pelodiscus sinensis in Taihu Basin

HAN Xiaolei1, GU Yi2, XU Mianmian1, SHA Yongliang2, XU Jianrong1, HAN Yaoping1
(1. School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500; 2. Taicang Xihuchuan Aquaculture Professional Cooperatives, Taicang 215400, China)

Q959.63

A

1008-2794（2017）04-0091-04

2017-02-20

江蘇省科技支撐計劃（農(nóng)業(yè)部分）項目“大規(guī)格仿野生中華鱉生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)示范與推廣”（BE2013349）

韓曜平，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)，E-mail：975683768@qq.com.