孫 晶， 范 佳， 王婷婷， 侯瑋琛， 鄭勝哲

AD的病理特征為神經(jīng)元數(shù)量減少、細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結和細胞外β樣淀粉蛋白(amyloid beta,Aβ)沉積[1]。在疾病早期，AD患者腦組織內(nèi)即可見到聚集狀的 Aβ[2]，通過調(diào)節(jié)下游信號途徑如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等誘導神經(jīng)炎癥和氧化應激反應，并促進神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生的級聯(lián)反應推動著AD病變的發(fā)展[3,4]。然而，Aβ調(diào)控MAPK信號通路的具體分子機制尚未完全闡明。MKP1是絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKPs,mitogen-activated protein kinase phosphatases)家族中最重要的一員，是p38、JNK1/2和ERK1/2負調(diào)控的主要因子[5]。MKP1被報道在多種疾病發(fā)生發(fā)展中通過調(diào)控MAPK信號途徑參與氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡[6,7]，但MKP1/MAPK信號軸對Aβ所致氧化應激和炎癥反應的調(diào)控作用還未完全清楚。在本研究中。因此，本研究對MKP1在Aβ所致MAPK激活、神經(jīng)炎癥和細胞凋亡中的調(diào)控作用作初步探索，旨在為AD開發(fā)新的有潛力的臨床治療手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 野生型PC12細胞、過表達MKP1和穩(wěn)定敲除MKP1的PC12細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中，每3 d換液一次。

1.2 實驗試劑 CCK-8試劑盒購自于Sigma公司，過氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自于南京建成生物科技公司。MKP1和JNK抗體購自于Abcam公司。逆轉錄和PCR試劑盒購自于全式金公司。

1.3 實驗分組 在細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的Aβ42(0 μmol，0.1 μmol，1 μmol，10 μmol 和100 μmol，每組6孔)，處理24 h后CCK-8檢測細胞活性。向細胞培養(yǎng)基中加入10 μmol 的Aβ42，在不同時間點(0 h、6 h、12 h、18 h和24 h，每組6孔)，通過qRT-PCR和Western blot檢測MKP1表達。將野生型PC12細胞分為對照組(Control)和Aβ42組，敲除MKP1的細胞為MKP1 KD+Aβ42組，過表達MKP1細胞為MKP1+Aβ組，每組6孔，后3組加入10 μmol Aβ42，置于培養(yǎng)箱中24 h后進行氧化應激和炎癥反應的檢測。

1.4 CCK-8檢測 為檢測各組細胞的細胞活性，按照說明書對各組細胞進行CCK-8檢測，檢測過程簡略如下：將細胞接種到96孔板中(4000/well)，按不同濃度(0、0.1、1、10、100 μmol )Aβ處理后，更換培養(yǎng)基。每孔加入10 μl CCK8。繼續(xù)培養(yǎng)2 h。于酶標儀下測定450 nm吸光度。

1.5 qRT-PCR 按照說明書方法通過Trizol提取總RNA，使用Superscript III Reverse Transcriptase試劑盒進行cDNA合成。將2.5 μl合成的cDNA、1 μl特異性引物與qPCR試劑充分混合后，在ABI 7500 PCR儀上進行實時定量PCR測定，以GAPDH mRNA內(nèi)參，定量產(chǎn)物濃度。

1.6 Western blot檢測 提取細胞總蛋白，測定總蛋白濃度。每個樣品取總蛋白15 μg與4 μl 6×loading buffer混合，行10% SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳，濕法電轉膜，封閉2 h，洗脫后加一抗1∶1000于4 ℃孵育過夜，TBST洗脫，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后行ECL化學發(fā)光法顯示結果。

1.7 DCFH-DA檢測 為檢測細胞內(nèi)ROS水平，將2×105PC12細胞種于6孔板，按照說明書加入終濃度為 20 nmol/L的 DCFH-DA，于5% CO2，90%濕度，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況并拍照。

1.8 線粒體膜電位(ΔΨm)檢測 將PC12細胞按照2×105個/ml接種于6孔板，按照上述分組方法給予處理4組細胞。各組加入等量DMSO溶解的羅丹明123終濃度為5 μmol/L的Fluo-3/AM Ester和0.0625%重量比的Pluronic F127，于5%CO2、90%濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育45 min。PBS洗兩次后，1500 rpm離心5 min，在激發(fā)波長為485 nm時流式細胞儀檢測各組熒光強度(MFI)。

1.9 化學發(fā)光法檢測 嚴格按照說明書對細胞內(nèi)SOD活性和MDA水平行進檢測：細胞裂解后，12000 g離心，取上清液加入檢測液，95 ℃恒溫水浴40 min，冷卻后4000 g離心10 min。提取上清于波長532 nm，光徑1 cm處測定并記錄OD值。

2 結 果

2.1 Aβ42下調(diào)PC12細胞中MKP1的表達 隨濃度的增大，Aβ42對PC12的毒性增大，當Aβ42濃度大于10 μmol/L時，PC12細胞的活性受到明顯的抑制(P<0.01)，可使PC12細胞活性下降至正常細胞的50%。qRT-PCR結果顯示，10 μmol/L Aβ42刺激6 h，即可觀察到MKP1 mRNA的下降(P<0.05)，在刺激12 h時達到最底峰，約為正常水平的25%(P<0.01)。Western blot結果顯示，MKP1蛋白表達在Aβ42刺激12 h后出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.01)，在18 h時下調(diào)最為明顯，約為正常MKP1表達水平的30%。

2.2 MKP1調(diào)控Aβ42所致的氧化應激反應 Aβ42可導致PC12細胞中大量ROS生成，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光。敲除MKP1后，PC12細胞中熒光強度明顯高于Aβ42組，而過表達MKP1可減輕PC12細胞中的熒光強度。通過流式細胞術檢測我們可以發(fā)現(xiàn)Aβ42可下調(diào)PC12細胞的ΔΨm(P<0.05)，而過表達MKP1可恢復PC12細胞的ΔΨm水平(P<0.05)。敲除MKP1會下調(diào)PC12細胞中SOD活性(P<0.01)，但并不會增加MDA水平(P>0.05)。而過表達MKP1可上調(diào)SOD活性(P<0.05)，并下調(diào)MDA水平(P<0.01)。

2.3 MKP1調(diào)控Aβ42所致的神經(jīng)炎癥 Aβ42刺激可上調(diào)p-JNK含量，敲除MKP1可進一步增加這種作用(P<0.05)，而過表達MKP1可減輕這種作用(P<0.05)。通過qRT-PCR對PC12細胞中炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA水平進行檢測，結果顯示敲除MKP1可加重Aβ42刺激對炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA表達的上調(diào)作用(P<0.05)，而過表達MKP1可減輕Aβ42刺激所引起的炎癥因子釋放(P<0.05)。

3 討 論

在AD早期，Aβ在腦組織中聚集，可通過激活MAPK下游信號通路誘導大量ROS生成以及強烈持續(xù)的炎癥反應，這最終導致了神經(jīng)細胞的凋亡[8]。這些現(xiàn)象很早即在AD動物模型和體外實驗中被驗證，然而Aβ是如何激活MAPK信號途徑，我們目前所知還很少。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Aβ42對PC12細胞的毒性作用隨濃度的增大而增大，當Aβ42濃度為10 μmol/L時，PC12細胞活性下降至正常細胞的50%，因此我們選擇該濃度觀察Aβ42對PC12細胞中MKP1表達的影響。我們的結果顯示，Aβ42刺激6 h時即可觀察到MKP1 mRNA的下降，但蛋白表達在12 h左右才發(fā)生明顯變化。MKP1 mRNA在刺激12 h時達到最底峰，而其蛋白表達在18 h時才出現(xiàn)該種現(xiàn)象。MKP1在Huntington’s disease患者腦組織內(nèi)表達下調(diào)[9]，但目前尚無AD疾病中MKP1表達變化的數(shù)據(jù)。我們的結果初步顯示，至少在體外MKP1在Aβ的作用下是表達下調(diào)的，提示MKP1可能參與到Aβ致病的機制中。

大量證據(jù)表明，ROS生成過多伴隨抗氧化能力的相對不足導致的氧化應激反應在AD中扮演著重要的角色[10,11]。在本研究中，通過DCFH-DA檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Aβ42刺激之后PC12細胞內(nèi)綠色熒光DCF表達增強，表明Aβ可誘導神經(jīng)細胞中ROS的大量生成。敲除MKP1后，PC12細胞中ROS生成明顯增多，而過表達MKP1可減輕PC12細胞中ROS含量。ΔΨm是反應氧化應激的一個生物學指標，ROS可導致其ΔΨm的降低[12]。敲除MKP1或過表達MKP1同樣會相應下調(diào)或上調(diào)Aβ42引起的線粒體膜電位損害效應。并且，敲除MKP1會下調(diào)PC12細胞中SOD的活性，而過表達MKP1可上調(diào)SOD活性并下調(diào)MDA水平。此結果表明MKP1具有調(diào)節(jié)Aβ所致神經(jīng)細胞內(nèi)氧化應激的作用。JNK是MAPK通路的一重要分支，在炎癥發(fā)生過程中起重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Aβ42刺激后，細胞內(nèi)p-JNK含量增多，表明Aβ可促進JNK的活化。而在敲除或過表達MKP1的細胞中的結果表明，MKP1可以調(diào)控由Aβ誘導的JNK信號通路的激活，并可以減輕炎癥因子TNF-α和IL-1β的生成。

綜上，我們的研究結果表明，Aβ刺激可下調(diào)MKP1表達，而MKP1可通過下調(diào)JNK信號通路調(diào)控Aβ所致的氧化應激和炎癥反應。本研究不僅解釋了Aβ激活MAPK信號途徑的機制，還為靶向作用于JNK信號軸的AD治療藥物的研發(fā)提供了一條新途徑。

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