唐 姝， 熊金波， 王 凱， 胡常巨， 鄭嘉來， 張德民

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

象山港海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)弧菌群落動態(tài)變化

唐 姝， 熊金波， 王 凱， 胡常巨， 鄭嘉來， 張德民

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

象山港養(yǎng)殖區(qū)是我國典型海水養(yǎng)殖區(qū)，弧菌(Vibrio)是引起魚類細(xì)菌性疾病的重要病原菌之一。研究于2012年8月—11月，采集象山港大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)外海水和魚體樣品分析弧菌群落組成及其動態(tài)演替。典型對應(yīng)分析結(jié)果表明養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)弧菌群落隨時間變化顯著。溫度、總有機(jī)碳、總磷和活性磷酸鹽是弧菌群落結(jié)構(gòu)變異的最大環(huán)境驅(qū)動因子。采用16S rRNA和rpoA鑒定海水和魚體組織中分離出的優(yōu)勢菌株，表明養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)的弧菌群落組成不同，且病害暴發(fā)時對照區(qū)哈維弧菌(Vibrioharveyi)豐度突增。因此，哈維弧菌可作為預(yù)測象山港養(yǎng)殖魚類患病的快速檢測指標(biāo)。病害暴發(fā)后由于投加抗生素，養(yǎng)殖區(qū)和魚體組織中纖細(xì)發(fā)光桿菌(Photobacteriumangustum)豐度突增。

弧菌；群落結(jié)構(gòu)；魚類病害；環(huán)境因子

隨著海洋捕撈產(chǎn)量急劇下降，海產(chǎn)品需求的增長更大程度上依靠海水養(yǎng)殖業(yè)，其中網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)占據(jù)了重要地位[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展；但與此同時，各種病害頻繁發(fā)生已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸[2-3]。弧菌是海水養(yǎng)殖動物最常見且危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一，其宿主范圍廣泛，包括魚、蝦、貝類等幾乎所有水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，流行面積大、死亡率高，容易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

象山港位于浙江省寧波市東南部，是我國主要海水養(yǎng)殖區(qū)之一。隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，科學(xué)管理的缺乏，象山港水質(zhì)環(huán)境逐步惡化，養(yǎng)殖病害發(fā)生日益頻繁，嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[6-7]。研究表明弧菌群落與環(huán)境因子的變化聯(lián)系密切[8-9]，網(wǎng)箱養(yǎng)殖可顯著改變海水理化性質(zhì)進(jìn)而影響弧菌群落[10]。然而，大多數(shù)象山港養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)方面的研究集中在浮游動植物、底棲生物，關(guān)于微生物生態(tài)特別是弧菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子間關(guān)系的報(bào)道較少[11-13]。作者選取象山港大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)作為供試區(qū)，監(jiān)測了在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)中海水和魚體弧菌種類與數(shù)量變化，研究分析弧菌群落與主要環(huán)境因子之間的關(guān)系，探究海水弧菌群落與魚類病害暴發(fā)的潛在關(guān)聯(lián)，以期為象山港海域整治及當(dāng)?shù)卮簏S魚病害的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與分離培養(yǎng)

2012年8月13日至11月20日，以寧波市象山港大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)(N區(qū)，N: 29°31′58.14″, E:121°45′11.71″)和養(yǎng)殖外圍航道區(qū)(C區(qū)，距N區(qū)1000 m，N:29°32′21.99″, E:121°45′36.48″)為研究區(qū)域，采集海水和大黃魚樣品。采樣時間分別為2012年8月13日、8月29日、9月20日、10月9日、10月31日和11月20日，按《海洋環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》采集水樣和大黃魚樣品。水樣和大黃魚樣品采集后帶回實(shí)驗(yàn)室在4 h內(nèi)處理。監(jiān)測周期內(nèi)，8月8日臺風(fēng)“?？钡顷懀?月13日至15日發(fā)生了赤潮，9月15日發(fā)生了大規(guī)模大黃魚病害。

1.2 環(huán)境因子分析方法

1.3 異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌計(jì)數(shù)及分離

采集的海水樣品用無菌生理鹽水按10倍濃度梯度系列稀釋，取100 μL進(jìn)行涂布?？偖愷B(yǎng)細(xì)菌數(shù)量采用LB平板涂布法，可培養(yǎng)弧菌數(shù)采用TCBS(Thiosulfate citrate bile saccharose)平板涂布法。選取菌落數(shù)1～300的TCBS平板，隨機(jī)挑取30株單菌落(低于30株則全部挑取)，用LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基連續(xù)分離純化2次，得到純菌株。同時，對大黃魚肝、脾、腎組織進(jìn)行NA(Nutrient agar)平板劃線培養(yǎng)，挑取優(yōu)勢菌株于LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)分離純化。純化后的菌株加25%無菌甘油，-80℃保存。PCR擴(kuò)增純化菌株的16S rRNA基因及rpoA基因，送上海生工公司進(jìn)行序列測定。所用引物及PCR擴(kuò)增條件如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序結(jié)果與NCBI和EzdTaxon[16]數(shù)據(jù)庫中模式菌株的序列比對，通過16S rRNA基因的相似性比較初步判斷對應(yīng)弧菌菌株的種屬，再用rpoA序列進(jìn)行比對驗(yàn)證。運(yùn)用SPSS17.0軟件的Pearson相關(guān)性分析，分析可培養(yǎng)弧菌及總異養(yǎng)菌豐度間的相關(guān)性。采用典型對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis, CCA)揭示海水弧菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境驅(qū)動因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 海水環(huán)境因子變化動態(tài)

表1 所用PCR引物序列及擴(kuò)增條件

表 2 象山港養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)海水樣品的環(huán)境因子

2.2 海水總異養(yǎng)菌及弧菌豐度動態(tài)

我們在最易暴發(fā)病害的夏秋季節(jié)檢測了養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)表層海水的總異養(yǎng)菌和弧菌的變化，發(fā)現(xiàn)兩個區(qū)域的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度的變化趨勢不同(圖1)。8月中下旬(13日和29日兩個時間點(diǎn))，養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度都相近；但9月20日，養(yǎng)殖區(qū)的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度變化不大，而對照區(qū)則明顯上升，結(jié)果，對照區(qū)的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度明顯高于養(yǎng)殖區(qū)一到兩個數(shù)量級；之后的10月9日，情況反轉(zhuǎn)，養(yǎng)殖區(qū)總異養(yǎng)菌和弧菌豐度急劇上升，而對照區(qū)則明顯下降，結(jié)果養(yǎng)殖區(qū)的總異養(yǎng)菌和弧菌高出對照區(qū)一到兩個數(shù)量級；之后的兩個時間點(diǎn)(10月30日和11月20日)都延續(xù)了養(yǎng)殖區(qū)高于對照區(qū)的趨勢。

圖1 象山港夏秋季節(jié)總異養(yǎng)菌及弧菌豐度變化圖Fig 1 Abundance of total heterotrophic bacteria and Vibrio during summer and autumn in Xiangshan Bay●、◆：養(yǎng)殖區(qū)細(xì)菌豐度；○、◇：對照區(qū)細(xì)菌豐度；●、○：總菌豐度；◆、◇：弧菌相對豐度；★、☆，弧菌占總異養(yǎng)細(xì)菌的比例

兩個區(qū)域的弧菌豐度與總異養(yǎng)菌豐度成正相關(guān)(養(yǎng)殖區(qū)：R=0.996，P=0.021；對照區(qū)：R=0.981，P< 0.001)，弧菌是海水細(xì)菌的優(yōu)勢菌(占總異養(yǎng)細(xì)菌的8.72%～68.07%)?；【c異養(yǎng)細(xì)菌的比例除養(yǎng)殖區(qū)一個時間點(diǎn)(9月20日)外，表現(xiàn)出兩頭低，中間高的趨勢，總體上變化范圍在10%～40%之間。但在9月20日，對照區(qū)弧菌的數(shù)量和豐度都明顯增高，與總異養(yǎng)菌的比例接近1∶1，與此形成鮮明對照的是養(yǎng)殖區(qū)弧菌的比例卻明顯降低，只有總異養(yǎng)菌的10%多，其豐度比對照區(qū)低兩個數(shù)量級。

圖2 典型對應(yīng)分析揭示海水弧菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境驅(qū)動因子的相關(guān)性Fig 2 Canonical correspondence analysis (CCA) illustrates the correlation of the seawater Vibrio community structure with the environmental driving factorsN：養(yǎng)殖區(qū)；C：對照區(qū)；Tem：溫度；TP：總磷；磷酸鹽； TOC：總有機(jī)碳

2.3 弧菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子相關(guān)性

2.4 海水及魚體組織優(yōu)勢細(xì)菌分離株種類分布

從TCBS平板上共分離出332株海水細(xì)菌以及43株魚體組織細(xì)菌。海水細(xì)菌包括36種弧菌，其中溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)、強(qiáng)壯弧菌(Vibrio.fortis)、哈維弧菌(Vibrio.harveyi)、巴西弧菌(Vibrio.brasiliensis)、大菱鲆弧菌(Vibrio.scophthalmi)、輪蟲弧菌(Vibrio.rotiferianus)、東方弧菌(Vibrio.orientalis)、副溶血性弧菌(Vibrio.parahaemolyticus)等14種弧菌所占比例較大，為象山港海水主要弧菌種類。其他異養(yǎng)菌中美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacterium.damselaesubsp.Piscicida)、纖細(xì)發(fā)光桿菌和鰒發(fā)光桿菌(Photobacterium.leiognathi)所占比例最高，為象山港海水主要異養(yǎng)菌種類(表3)。43株魚體組織細(xì)菌中哈維弧菌檢出率最高，所占比例最大，達(dá)20.8%(表4)。8月13日，魚體組織中未分離到菌株，之后弧菌和哈維弧菌豐度呈現(xiàn)規(guī)律性動態(tài)變化。8月29日魚體組織中哈維弧菌豐度上升，于9月20日達(dá)到峰值。海水樣品中，對照區(qū)中哈維弧菌豐度也呈現(xiàn)類似的動態(tài)變化， 8月29日，對照區(qū)海水中哈維弧菌豐度最高。11月20日，魚體組織中未分離得弧菌菌株，異養(yǎng)菌纖細(xì)發(fā)光桿菌所占比例最大，達(dá)57.1%(表4)。此時，養(yǎng)殖區(qū)海水樣品中纖細(xì)發(fā)光桿菌豐度也達(dá)到峰值，顯著高于對照區(qū)海水樣品，占海水纖細(xì)發(fā)光桿菌總豐度的94.7%(表3)。

表3 海水弧菌類細(xì)菌(TCBS平板分離)的種類分布

N：養(yǎng)殖區(qū)；C：對照區(qū)；V.：Vibrio；S.：Shewanella；P.：Photobacterium

3 討論

3.1 海水總異養(yǎng)菌和弧菌豐度變化

8月中下旬(8月13日和8月29日)，養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)間的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度相近，但8月13日兩者豐度均高于8月29日(圖1)。這可能是由于8月13日暴發(fā)赤潮(葉綠素濃度激增，見表2)，浮游植物生物量升高導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量激增[9, 17-19]。研究表明細(xì)菌數(shù)量與鹽度負(fù)相關(guān)[4]， 8月8日臺風(fēng)帶來的暴雨導(dǎo)致8月13日海水鹽度最低(20‰，見表2)，且臺風(fēng)引起的雨水流入以及沉積物擾動[20-21]，均可導(dǎo)致8月13日總異養(yǎng)菌和弧菌豐度較高。之后的4個時間點(diǎn)(9月20日，10月9日、10月30日和11月20日)，兩個區(qū)域的總異養(yǎng)菌和弧菌豐度變化動態(tài)不同。對照區(qū)總異養(yǎng)菌和弧菌豐度于9月20日達(dá)到峰值后急劇下降，而養(yǎng)殖區(qū)總異養(yǎng)菌、弧菌豐度以及弧菌相對豐度出現(xiàn)強(qiáng)勢反彈，分別于10月9日和10月31日達(dá)到峰值(圖2)。這個結(jié)果可能跟病害的暴發(fā)和其后的干預(yù)措施有關(guān)。9月15日，養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)了大規(guī)模大黃魚病害，養(yǎng)殖戶在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)投加了大量抗生素，抑制了養(yǎng)殖區(qū)弧菌的生長，同時也制約了總異養(yǎng)菌的生長，結(jié)果出現(xiàn)養(yǎng)殖區(qū)總異養(yǎng)菌和弧菌豐度明顯低于對照區(qū)的結(jié)果。9月20日后，養(yǎng)殖區(qū)總異養(yǎng)菌和弧菌豐度出現(xiàn)強(qiáng)勢反彈。微生物中存在k-r選擇，弧菌屬于r細(xì)菌，適宜的情況下極易大量繁殖[4, 17]。9月20日后隨著病害程度降低，養(yǎng)殖區(qū)抗生素投加量逐漸減少，對弧菌的抑制作用逐漸減弱，弧菌大量繁殖。此外，由于外源抗生素施用，某些弧菌可能已產(chǎn)生抗藥性，這些都導(dǎo)致病害暴發(fā)(9月15日)后養(yǎng)殖區(qū)弧菌相對豐度明顯上升。因此，投加抗生素并不是可持續(xù)的防治養(yǎng)殖病害手段，病害消失后仍需密切關(guān)注弧菌群落動態(tài)并采取相應(yīng)措施，防止病害再度暴發(fā)。

表4 患病魚體組織中細(xì)菌(TCBS平板分離)的種類分布

V.：Vibrio；P.：Photobacterium；Pse.：Pseudomonas；Sta.：Staphylococcus

3.2 海水弧菌群落的主要驅(qū)動因子

3.3 弧菌群落與大黃魚病害間的關(guān)系

弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見的條件致病菌，其致病性取決于養(yǎng)殖動物生理狀態(tài)及海水環(huán)境因子[4]。本研究中，養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)海水弧菌群落α-多樣性差異不顯著，且未發(fā)現(xiàn)與大黃魚病害暴發(fā)存在關(guān)系(數(shù)據(jù)未列出)。之前報(bào)道指出弧菌致病性與弧菌數(shù)量密切相關(guān)，弧菌數(shù)量越高，病害暴發(fā)概率越大[8, 20, 27]。然而本研究中大黃魚病害暴發(fā)(9月15日)前，對照區(qū)海水弧菌豐度未有上升，且病害暴發(fā)前后，弧菌群落差異不明顯，說明本研究中海水弧菌群落可能主要通過某一種或幾種特定弧菌導(dǎo)致大黃魚病害暴發(fā)。8月29日，魚體組織中哈維弧菌豐度上升，9月15日即暴發(fā)了大規(guī)模魚類病害。病害發(fā)生后(9月20日)，魚體組織中哈維弧菌豐度最高。病魚表現(xiàn)為魚尾潰爛、皮膚破裂，與感染哈維弧菌特征類似[28-29]。此外，對照區(qū)哈維弧菌豐度也于病害暴發(fā)前達(dá)到最大值。因此，哈維弧菌可能是象山港大黃魚病害的主要致病源，可成為潛在的預(yù)測預(yù)警象山港大黃魚病害發(fā)生的指示生物因子。這與龐觀宏[4]在湛江港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)的研究結(jié)果一致：夏秋季，海水弧菌主要以哈維氏弧菌出現(xiàn)，對應(yīng)的水體環(huán)境污染相對嚴(yán)重，生態(tài)風(fēng)險較高。此外，大黃魚病害暴發(fā)(9月15日)后，11月20日養(yǎng)殖區(qū)和對照區(qū)弧菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯增大，這主要是由纖細(xì)發(fā)光桿菌所致(圖2)。纖細(xì)發(fā)光桿菌在魚體組織和養(yǎng)殖區(qū)海水中增長迅速，成為11月20日魚體組織和養(yǎng)殖區(qū)海水的主要種群，而在對照區(qū)海水中豐度很低。研究表明纖細(xì)發(fā)光桿菌對青霉素、鏈霉素、羥氨芐青霉素等抗生素有抗性[30]，病害暴發(fā)后，大量抗生素被投加至養(yǎng)殖區(qū)水體，抑制了多種細(xì)菌的生長，可能反而促進(jìn)了纖細(xì)發(fā)光桿菌的繁殖。因此，纖細(xì)發(fā)光桿菌可能可作為病害暴發(fā)后的環(huán)境指示菌。

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Dynamics of theVibriocommunity in aquaculture area of Xiangshan harbour, Ningbo

TANG Shu, XIONG Jin-bo, WANG Kai, HU Chang-ju, ZHENG Jia-lai, ZHANG De-min

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Vibrio; community structure; fish diseases; environmental parameters

2016-06-06；

2016-06-21

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (2012AA092001)

唐 姝，碩士研究生，主要從事海洋微生物學(xué)研究，E-mail: 272280750@qq.com

張德民，教授，主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究，E-mail: zhangdemin@nbu.edu.cn

Q938.1

A

2095-1736(2017)04-0076-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.076