安紅強(qiáng)， 王萬(wàn)軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

鐵皮石斛胚胎發(fā)生相關(guān)基因DoEMB8的克隆及表達(dá)分析

安紅強(qiáng)， 王萬(wàn)軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

采用RACE和巢式PCR技術(shù)克隆出鐵皮石斛胚胎發(fā)生相關(guān)基因DoEMB8(Embryogenesis-associated protein EMB8)序列。序列分析表明該基因全長(zhǎng)2077 bp，包含一個(gè)1824 bp的CDS，編碼608個(gè)氨基酸殘基。分子進(jìn)化分析顯示，DoEMB8與海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等單子葉植物的親緣關(guān)系較近?？缒^(qū)分析顯示DoEMB8蛋白含有兩個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位顯示該基因可能存在于線粒體。RT-qPCR分析表明，DoEMB8在原球莖不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較為恒定，在PLB(Protocorm like body)中的表達(dá)量較原球莖不同時(shí)期要高，在組織表達(dá)分析中，種子中的表達(dá)量最高，較根中的表達(dá)量上升了3.16倍，表明該基因在胚胎發(fā)育時(shí)期有著持續(xù)穩(wěn)定且較高的表達(dá)，可能對(duì)植物胚胎發(fā)育起著重要作用。

鐵皮石斛； 胚胎發(fā)育相關(guān)基因； RACE； RT-qPCR

在大多數(shù)綠色植物中，胚胎發(fā)生在植物的生命周期中扮演著重要作用[1-2]。植物的胚胎發(fā)生是指從單細(xì)胞的受精卵到多細(xì)胞種胚的發(fā)育分化過(guò)程，胚胎形成包含兩個(gè)明顯的階段：早期形態(tài)學(xué)事件和后期生殖細(xì)胞的形成[3-4]。在植物胚胎發(fā)育過(guò)程中，成熟的植株都會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)基本的形體發(fā)育過(guò)程，這包括芽、根端分生組織、子葉、幼根和子葉下胚軸的形成，之后，植物基底端軸線、徑向元素、表皮、基本組織和維管結(jié)構(gòu)會(huì)隨之形成；這些要素在植物胚胎發(fā)育的早期形成，并在植物整個(gè)生命周期中穩(wěn)定存在[5-9]。植物胚胎形成是一個(gè)非常復(fù)雜和有序的生物學(xué)過(guò)程，受到一些獨(dú)特基因群組的調(diào)控[10-12]，它是基因在機(jī)體內(nèi)外因素協(xié)同作用下，在時(shí)間和空間上順序表達(dá)的過(guò)程[13]。受精卵極性的建立是胚胎發(fā)育的第一步，而第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與極性建立有關(guān)的基因是GNDM/EMB30(GN)，該基因的突變體造成胚胎失去根部和下胚軸[14-15]。因而EMB可能對(duì)植物胚胎發(fā)生過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，通常生長(zhǎng)于懸崖和林中覆蓋有苔蘚的樹(shù)干上[16-17]，由于其在自然環(huán)境中萌發(fā)率極低，因而對(duì)該植物的研究通常通過(guò)人工組培的方式進(jìn)行。其種胚發(fā)育過(guò)程要經(jīng)過(guò)原球莖時(shí)期，由于其種胚較小，因而對(duì)其種胚發(fā)育的研究比較困難，且原球莖發(fā)育的分子機(jī)理尚不清楚。本研究擬根據(jù)鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組序列片段，采用RACE技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)基因DoEMB8進(jìn)行克隆擴(kuò)增，并采用生物信息學(xué)手段對(duì)該基因的編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析和功能預(yù)測(cè)，再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和2-△△Ct方法對(duì)該基因在原球莖不同發(fā)育時(shí)期及不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析，推測(cè)該胚胎發(fā)育相關(guān)基因在原球莖時(shí)期的功能，為后續(xù)研究該基因調(diào)控鐵皮石斛胚胎發(fā)育分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛種子源自云南，接種于含1.07 μmmol/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基上，在種子發(fā)育的不同階段分別取原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織形成、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成和原球莖退化共7個(gè)時(shí)期材料；從體胚誘導(dǎo)而來(lái)的材料中取類原球莖(protocorm-like body, PLB)；從接種于1/2MS培養(yǎng)基上的幼苗取根、莖、葉3種組織材料；從實(shí)驗(yàn)室花盆栽培的成熟的鐵皮石斛植株上取整個(gè)花朵和種子，取材后液氮速凍保存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

取上述凍存的材料，用液氮研磨進(jìn)行組織破碎，采用Plant RNA Kit (OMEGA BIO-TEK)試劑盒提取鐵皮石斛總RNA，通過(guò)RNase-free DNase I (TaKaRa, 大連)在膜上消化去除總RNA中的基因組污染。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定完整性，D260 nm/280 nm比值法進(jìn)行RNA純度鑒定，取1 μg電泳條帶完整，D260 nm/280 nm比值位于1.8～2.1的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶采用TaKaRa的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，cDNA稀釋10倍后凍存于-80℃用于后續(xù)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RACE克隆及測(cè)序分析

以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)過(guò)的轉(zhuǎn)錄組序列片段為模板，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3′RACE巢式引物，在模板序列3′端設(shè)計(jì)兩個(gè)上游引物EMB8-3R和EMB8-3RN，送交成都擎科生物公司合成，并與下游通用引物3RP和3RNP配對(duì)使用進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR克隆產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收，構(gòu)建重組載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，搖菌活化后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，最終挑取陽(yáng)性單克隆送交成都擎科生物公司測(cè)序。測(cè)序得到的序列經(jīng)NCBI中的Blastn比對(duì)分析確認(rèn)為EMB8目的基因后，與原轉(zhuǎn)錄組序列拼接得到DoEBM8序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用NCBI的BlastP進(jìn)行蛋白相似性比對(duì)，并取排名靠前的前15個(gè)物種的相似序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選取最大分值667分以上，序列覆蓋度87%以上的25個(gè)物種EMB同源序列，用于后續(xù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用NCBI中的Open Reading Frame Finder (ORF Finder) 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORF)查找，Conserved domains(CDD)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，bioXM用于編碼區(qū)(CDS)蛋白翻譯，采用DNAStar中的Protean進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。使用ProtParam 進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，TMHMM進(jìn)行跨膜區(qū)分析，SignalP進(jìn)行信號(hào)肽分析，用TargetP預(yù)測(cè)DoEMB8蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為了研究鐵皮石斛不同原球莖發(fā)育時(shí)期及不同組織中DoEMB8的表達(dá)量情況，本文采用RT-qPCR方法來(lái)對(duì)其表達(dá)量情況進(jìn)行研究。以克隆拼接得到的基因序列為模板，根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，在基因3′端設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，Tm值為55℃～65℃，引物長(zhǎng)度介于18～30 bp之間，引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為100～300 bp(表1)。以Actin作為內(nèi)參基因，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)采用TaKaRa的SYBR Premix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, 大連)，在Roche公司的LightCycler?96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體積為10 μL: 5 μL SYBR Premix，0.8 μL (5 μmol)每個(gè)引物，2.9 μL ddH2O，0.5 μL cDNA，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)；最后95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s用于生成M值熔解曲線。同一樣本反應(yīng)設(shè)立3個(gè)技術(shù)重復(fù)孔，每種樣本設(shè)立3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。技術(shù)重復(fù)誤差采用儀器配套軟件LightCycler?96 SW 1.1分析，所有技術(shù)重復(fù)誤差均≤0.25，采用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 RACE克隆及RT-qPCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1DoEMB8序列結(jié)構(gòu)分析

3′RACE克隆得到了348 bp的3′末端序列(圖1)，與轉(zhuǎn)錄組片段拼接后共得到2077 bp的基因序列，采用NCBI中的ORF Finder查找到最長(zhǎng)的ORF位于14～1837 bp之間，編碼608aa的氨基酸殘基序列。利用DNASTAR中的Protean對(duì)DoEMB8蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)分析如圖2所示，該蛋白含有21個(gè)α螺旋，45個(gè)β折疊，33個(gè)γ轉(zhuǎn)角及26個(gè)無(wú)規(guī)卷曲。NCBI的CDD結(jié)構(gòu)域分析顯示，該基因在124～445位氨基酸殘基之間含有一個(gè)Abhydrolase super family結(jié)構(gòu)域，在187～428位氨基酸殘基之間含有一個(gè)Abhydrolase_1結(jié)構(gòu)域特征，多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，DoEMB8蛋白序列較為保守，尤其在結(jié)構(gòu)域中保守性更高。

圖1 RNA電泳圖及DoEMB8 3′RACE擴(kuò)增結(jié)果

A：泳道1～13分別代表原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化、類原球莖PLB、根、莖、葉、花和種子RNA電泳圖；B：表示3′RACE擴(kuò)增結(jié)果

圖2 鐵皮石斛DoEMB8蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Fig 2 The secondary structure ofD.officinaleDoEMB8 protein

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖4中可以看出，青梨(Pyrusxbretschneideri)、梅花(Prunusmume)、草莓(Fragariavescasubsp.vesca)、落花生(Arachisipaensis)、綠豆(Vignaradiatavar.radiata)、大豆(Glycinemax)聚為一支A；陸地棉(Gossypiumhirsutum)、麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)、蓖麻(Ricinuscommunis)聚為一支B；葡萄(Vitisvinifera)、巨桉(Eucalyptusgrandis)聚為一支C；甜菜(Betavulgarissubsp.vulgaris)、猴面花(Erythrantheguttata)、芝麻(Sesamumindicum)聚為一支D；荷花(Nelumbonucifera)單成一支E，以上幾支A-E同屬雙子葉植物(I類)。鐵皮石斛單成一支G；海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)聚為一支H；菠蘿(Ananascomosus)、狗尾草(Setariaitalica)、水稻(OryzasativaJaponicaGroup)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)和甘蔗(SaccharumhybridcultivarR570)聚為一支I，且H和I兩支與鐵皮石斛情緣關(guān)系較近，它們們同屬單子葉植物(II類)。而無(wú)油樟(Amborellatrichopoda)單成一支F，處于I類與II類之間，這與其在植物進(jìn)化關(guān)系中自成一目一科一屬的植物學(xué)分類特征相一致。

2.3 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam在線軟件對(duì)DoEMB8蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，分子質(zhì)量為67 049.9 u，等電點(diǎn)為6.55，帶負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)62，帶正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)59，分子式為C3013H4715N813O872S24，脂肪系數(shù)為96.83，親水系數(shù)為0.062，不穩(wěn)定系數(shù)為46.56，屬于不穩(wěn)定蛋白。采用TMHMM在線軟件對(duì)DoEMB8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示，該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，在第60～82和571～593位氨基酸處含有兩個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，1～59位氨基酸和594～608位氨基酸處于細(xì)胞膜內(nèi)，83～570位氨基酸處于細(xì)胞膜外(圖5)。SignalP在線軟件分析顯示該蛋白不含信號(hào)肽(圖6)。亞細(xì)胞定位分析表明，DoEMB8蛋白最有可能分布在線粒體中(0.165)，存在與分泌通路的可能性為0.060，葉綠體為0.038，在其他地方的可能性為0.491。

2.4 表達(dá)量分析

根據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算得到的DoEMB8的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示。從圖7-A可以看出，DoEMB8在原球莖的7個(gè)不同原球莖發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較為恒定，只是在根端分生組織形成(p7)時(shí)期表達(dá)量有所上升，而在由體胚誘導(dǎo)而來(lái)的類原球莖PLB中表達(dá)量較高，是種子萌發(fā)的原球莖形成時(shí)期(p2)的2.05倍，說(shuō)明該基因在整個(gè)原球莖發(fā)育時(shí)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。在不同組織中，DoEMB8在種子中的表達(dá)量最高(圖7-B)，較根中的表達(dá)量上升了3.16倍，在花中表達(dá)量最低，較根下降了4.32倍，葉中的表達(dá)量較根下降了1.45倍，莖和根的表達(dá)量較為一致，表明該基因在種子時(shí)期表達(dá)較不同組織中要高，也從側(cè)面說(shuō)明該胚胎發(fā)育相關(guān)基因在種胚及胚胎發(fā)育時(shí)期有著較高的表達(dá)量，可能在胚胎發(fā)育中起著重要作用。

圖3 不同物種EMB蛋白多重序列比對(duì)分析

圖4 不同植物EMB蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 DoEMB8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 DoEMB8蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖7原球莖不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中DoEMB8的表達(dá)量

A中p2～p8分別代表原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化；PLB代表類原球莖時(shí)期

3 討論

胚胎發(fā)生是植物生命周期中關(guān)鍵的階段[8, 19]，是一個(gè)精細(xì)和復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，按照預(yù)設(shè)的步驟進(jìn)行一系列的生物學(xué)進(jìn)程以完成胚胎發(fā)育[19]。雖然植物胚胎發(fā)生通常是在種子萌發(fā)的情況下研究的，但是植物胚胎的萌發(fā)也有其他可行的方法，如體細(xì)胞胚胎發(fā)生、小孢子胚胎發(fā)生、合子胚萌發(fā)等[20-21]，這些胚胎發(fā)生模式是開(kāi)花植物生命周期中重要的發(fā)育階段[21-23]。最近，有研究證實(shí)，基于幾個(gè)關(guān)鍵的胚胎發(fā)育過(guò)程標(biāo)記，早期的胚胎發(fā)生可以當(dāng)作研究植物發(fā)育的微型模型[24-25]，但是與植物的其他生物學(xué)過(guò)程相比，由于植物早期胚胎材料太小難以獲取，植物早期胚胎發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制仍有待繼續(xù)探索研究[22]。

目前，擬南芥[22-23]、歐洲油菜[26]、水稻[25]、陸地棉[27]和黃瓜[28]中均已鑒定出胚胎發(fā)生相關(guān)基因，例如：Tzafrir等采用胚胎缺損突變體方法在擬南芥中鑒定出244個(gè)正常胚胎發(fā)育所需的EMB基因[29]，但有關(guān)鐵皮石斛胚胎發(fā)育相關(guān)基因的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究中克隆得到的DoEMB8編碼一個(gè)跨膜蛋白，含有兩個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，該蛋白含有自水解酶超家族結(jié)構(gòu)域，且較為保守。分子進(jìn)化分析顯示DoEMB8同海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等單子葉植物的親緣關(guān)系最近，能較好地反映植物分類學(xué)特征。

胚胎發(fā)生相關(guān)基因是植物胚胎發(fā)育階段重要的基因，對(duì)該基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，有助于預(yù)測(cè)該基因在植物整個(gè)胚胎發(fā)育期可能具有的功能。本研究中，DoEMB8在鐵皮石斛原球莖不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較為恒定，只是在根端分生組織形成時(shí)期表達(dá)量較其他時(shí)期較高，說(shuō)明該基因在原球莖的發(fā)育歷程中有著穩(wěn)定的表達(dá)，對(duì)維持原球莖的生長(zhǎng)可能具有重要作用，這也與Skevell成功地利用T-DNA標(biāo)簽技術(shù)分離到EMB30，且該基因在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)所揭示的結(jié)果相一致[14]。而在由體胚誘導(dǎo)而來(lái)的類原球莖中，該基因的表達(dá)水平較種胚發(fā)育而來(lái)的原球莖要高出許多，說(shuō)明雖然有著相似的形態(tài)特征，但體胚誘導(dǎo)的類原球莖與原球莖在基因表達(dá)方面卻有著一定的差異。不同組織的表達(dá)水平分析顯示，DoEMB8在根、莖、葉和花中的表達(dá)量都較低，且有著相似的表達(dá)水平，而在種子中的表達(dá)水平較高，明顯高于前4種組織，表明DoEMB8在種子時(shí)期可能具有重要的作用，這也與該基因?qū)儆谂咛グl(fā)育相關(guān)基因的注釋信息相一致。

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Cloning and expression analysis of embryogenesis-associated protein EMB8 (DoEMB8) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

AN Hong-qiang, WANG Wan-jun

(School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

The embryogenesis-associated protein EMB8 (DoEMB8) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo was achieved by RACE and nest PCR technologies. The full length ofDoEMB8 was 2077 bp, contained an open reading frame (ORF) of 1824 bp that encoded 608 amino acid residues. Phylogenetic analysis showed that DoEMB8 had the closest relationship withPhoenixdactylifera,Elaeisguineensis,Musaacuminatasubsp.malaccensisand some other monocotyledon. DoEMB8 had 2 transmembrane helix structures and probably existed in mitochondrion analyzed by TMHMM and TargetP, respectively. RT-qPCR analysis showed that the expression level ofDoEMB8 was relatively constant in different development stages of protocorm, while it was higher in PLB(Protocorm like body) compared to that in protocorm. In different tissues, the expression level ofDoEMB8 was highest in seed and was 3.16 times higher than that in root, indicating thatDoEMB8 had relatively constant and higher expression level in embryonic development and may play an important role in plant embryonic development.

DendrobiumofficinaleKimuraetMigo; embryogenesis-associated protein EMB8; RACE; RT-qPCR

2016-08-01；

2016-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)(31371232)

安紅強(qiáng)，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：1528241699@qq.com

王萬(wàn)軍，教授，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail:wanjunwang@home.swjtu.edu.cn

Q78

A

2095-1736(2017)04-0001-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.001