劉寶修 黃建勝 朱乃碩

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子感染與免疫實(shí)驗(yàn)室 上海 200438)

AS1411介導(dǎo)STAT3反義寡核苷酸靶向抗腫瘤的作用

劉寶修 黃建勝 朱乃碩△

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子感染與免疫實(shí)驗(yàn)室 上海 200438)

目的 研究核仁素核酸適配體(AS1411)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)靶向抗腫瘤的作用。方法 以RNA為耦聯(lián)分子,連接靶向分子AS1411和效應(yīng)分子ASO。以RNA Structure軟件對(duì)預(yù)合成的不同RNA堿基耦聯(lián)構(gòu)建的嵌合體分子二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)嵌合體分子在血清及細(xì)胞裂解液中的穩(wěn)定性。通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AS1411介導(dǎo)STAT3 ASO進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的情況。通過CCK-8試劑盒檢測(cè)STAT3 ASO對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況。通過RT-PCR和Western blot分析ASO對(duì)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果 AS1411可介導(dǎo)STAT3 ASO高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,抑制C-myc、CyclinD1、Bcl-xl和PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,并能抑制Du145細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)論 AS1411可介導(dǎo)STAT3 ASO靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

反義寡核苷酸; AS1411; 抗腫瘤; 靶向

腫瘤是威脅公共健康的一類嚴(yán)重的疾病。近年來,我國(guó)腫瘤的發(fā)病率及死亡率均逐年上升。免疫抗腫瘤療法是近年來新興的抗腫瘤治療手段,主要包括以單克隆抗體介導(dǎo)的單抗藥物療法和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)[1-2],此類方法雖有良好的靶向性及較好的療效,但由于應(yīng)用范圍及作用時(shí)效的限制,臨床使用也存在一定的局限[3-4]。因此,研發(fā)新型低免疫原性小分子靶向藥物依然十分必要。

核酸適配體是寡聚體單鏈DNA或RNA,可高親和力、高特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白受體、多肽、胞內(nèi)生物大分子[5]。核仁素核酸適配體AS1411為26個(gè)堿基的單鏈DNA,序列為5’-GGTGGTGGTGGT-TGTGGTGGTGGTGG-3’,可高度特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面核仁素蛋白,親和常數(shù)(Kd)為(8.37±0.75)nmol/L。由于核仁素在正常細(xì)胞表面不表達(dá),僅在癌細(xì)胞或腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá),且在細(xì)胞表面與胞質(zhì)之間穿梭[6-9],是非常理想的靶向藥物結(jié)合點(diǎn)。研究表明,AS1411結(jié)合腫瘤細(xì)胞膜核仁素后,可誘導(dǎo)大胞飲作用(macropinocytosis)而快速進(jìn)入細(xì)胞,并通過誘導(dǎo)EGFR、Akt、p38和Rac1活性進(jìn)一步促進(jìn)大胞飲作用,最終導(dǎo)致非凋亡性細(xì)胞死亡[10-11]。因此,AS1411作為靶向分子具有親和力高、特異性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量小、無免疫原性、快速進(jìn)入胞質(zhì)、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、易于合成和生產(chǎn)(成本低)等顯著優(yōu)勢(shì),是一個(gè)十分理想的靶向抗腫瘤藥物載體。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)是一個(gè)與腫瘤高度相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控分子,可促進(jìn)成纖維細(xì)胞在淋巴結(jié)中成瘤,被認(rèn)為是一個(gè)癌基因[12-13]。它在多數(shù)癌細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的T細(xì)胞中呈活性形式,而在非活化的正常細(xì)胞中呈失活狀態(tài),且不是分化細(xì)胞生存所必需的[14]。Kortylewski等[15]研究表明,通過誘導(dǎo)小鼠造血細(xì)胞STAT3基因敲除,可顯著增強(qiáng)DC細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的抗腫瘤活性,對(duì)黑色素瘤及膀胱癌有明顯的抑制作用。因此,STAT3被認(rèn)為是一個(gè)很好的抗腫瘤靶標(biāo)。本研究通過將AS1411和STAT3反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)耦聯(lián)起來,研究該嵌合體分子在抗腫瘤中的應(yīng)用,以期為腫瘤治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

主要試劑及材料 RT-PCR引物及耦聯(lián)分子由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成(表1,表2);Du145細(xì)胞購(gòu)自ATCC (HTB-81TM);胎牛血清、Tripson、DMEM高糖培養(yǎng)基、無酶分離液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;細(xì)胞級(jí)PBS購(gòu)自加拿大Wisent公司;Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和qPCR SYBR Master Mix購(gòu)自日本TOYOBO公司;DAPI購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;氯仿、乙醇、異丙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;BB16UV型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司;LSM710型高感度激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司公司。

嵌合體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 以RNA Structure軟件對(duì)預(yù)合成的不同RNA堿基耦聯(lián)構(gòu)建的嵌合體分子二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

嵌合體分子血清穩(wěn)定性檢測(cè) 以去RNA酶水溶解各嵌合體寡核酸,配制濃度為10 nmol/L;取9μL核仁素核酸適配體嵌合體溶液,加入1μL血清,37 ℃下分別孵育0.5、1、2、3和4 h;以3%瓊脂糖膠電泳15 min,檢測(cè)嵌合體分子的完整性。

嵌合體分子細(xì)胞裂解液穩(wěn)定性檢測(cè) 取Du145細(xì)胞約1×107個(gè),以無酶分離液收集細(xì)胞;加入400μL PBS洗滌1次;加入100μL PBS重懸浮;-70 ℃反復(fù)凍溶吹打3次,使細(xì)胞破裂釋放細(xì)胞質(zhì);100×g離心3 min,取上清細(xì)胞裂解液,-70 ℃保存?zhèn)溆?取嵌合體分子各8μL,分別加入上述細(xì)胞裂解液2μL,37 ℃下分別孵育0.5、1、2和4 h;以3%瓊脂糖膠電泳15 min,檢測(cè)嵌合體分子的完整性。

表1 嵌合體分子堿基序列及修飾

Small letter indicated RNA.

表2 RT-PCR引物

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取Du145細(xì)胞接種于12孔板(2×105/孔),加入DMEM完全培養(yǎng)基1 mL,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h。取3孔細(xì)胞,分別加入FAM熒光標(biāo)記嵌合體分子、AS1411和效應(yīng)分子各10μL,使其終濃度達(dá)100 nmol/L,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)1 h,另取3孔細(xì)胞加入PBS作為空白對(duì)照;吸棄培養(yǎng)基,消化后清洗2次,PBS重懸,以流式細(xì)胞術(shù)分析FAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及其比例。

熒光共聚焦顯微鏡 取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入1 mL DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,雙抗);各孔加入1塊無菌蓋玻片,沉底,無氣泡;接種適量腫瘤細(xì)胞(1 mL)于蓋玻片之上,以DMEM (含10%胎牛血清),5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h;分別加入熒光標(biāo)記嵌合體分子、AS1411和效應(yīng)分子各20μL,使其終濃度達(dá)100 nmol/L,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)1 h;加入DAPI (100×) 10μL,5% CO2、37 ℃孵育20 min;吸棄培養(yǎng)基,加入1 mL PBS洗滌1次;取出蓋玻片,晾干,以50%甘油(以PBS稀釋)倒置吸附于載破片;高感度激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 取Du145細(xì)胞100μL (100 個(gè)/μL)接種于96孔板,每孔10 000 個(gè)細(xì)胞,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h;分別加入實(shí)驗(yàn)組嵌合體分子、對(duì)照組嵌合體分子各1μL (使其終濃度為100 nmol/L),以及空白對(duì)照,各組重復(fù)4孔;5% CO2、37 ℃分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h,以檢測(cè)細(xì)胞增殖;各孔分別加入5μL CCK-8試劑,5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h;以Spectrum M5檢測(cè)450 nm下各孔細(xì)胞的吸光度值(D)。

RT-PCR檢測(cè) 運(yùn)用real-time PCR的方法檢測(cè)Du145細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、Bcl-Xl和PD-L1基因mRNA的表達(dá)。以Trizol法抽提總的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。20μL反應(yīng)體系包括:qPCR SYBR Master Mix 10μL、cDNA模板3μL、上下游引物各1μL、ddH2O 4μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;58 ℃,30 s;72 ℃,1 min;循環(huán)40次。

Western blot檢測(cè) 運(yùn)用Western blot檢測(cè)Du145細(xì)胞中C-myc、Cyclin D1、Bcl-xL和PD-L1蛋白質(zhì)水平。將Du145細(xì)胞裂解,提取組織蛋白質(zhì),定量并分離,轉(zhuǎn)膜后分別與相應(yīng)蛋白質(zhì)抗體孵育并顯色。

結(jié) 果

嵌合體分子的二級(jí)結(jié)構(gòu) 在本研究中,設(shè)計(jì)通過RNA堿基耦聯(lián)核仁素核酸適配體AS1411和STAT3 ASO構(gòu)建嵌合體分子,從而介導(dǎo)高度靶向特異性給藥。為明確耦聯(lián)分子是否影響AS1411二級(jí)結(jié)構(gòu)及是否結(jié)合核仁素,以RNA Structure軟件分析耦聯(lián)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖1所示,C、G連接的AS-ASO二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致,但A耦聯(lián)的AS-ASO結(jié)構(gòu)有所不同。但無論哪種連接,核酸適配體AS1411 5’端大部分DNA呈單鏈狀態(tài),僅在16個(gè)堿基后有3～4個(gè)堿基構(gòu)成的堿基對(duì),且并非完全匹配。因此,認(rèn)為RNA堿基(A、C、G)單堿基或雙堿基耦聯(lián)的AS-ASO嵌合體分子二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致,不會(huì)對(duì)AS1411核仁素的親和力造成大的影響。

圖1 嵌合體分子二級(jí)結(jié)構(gòu)

嵌合體分子在血清中的穩(wěn)定性 合成的嵌合體分子若能在血清中穩(wěn)定存在,而進(jìn)入細(xì)胞后又可快速分離,那就不會(huì)在血液循環(huán)系統(tǒng)中過早釋放效應(yīng)分子而造成藥物毒性作用和不良反應(yīng)。考慮到嘧啶堿基穩(wěn)定性更差,因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為:分別以RNA單堿基A、C、G或雙堿基AA、AG、GA、GG、CG耦聯(lián)核仁素核酸適配AS1411和STAT3 ASO,分別以未耦聯(lián)的AS1411 (N)和DNA耦聯(lián)的嵌合體分子(P)作對(duì)照(圖2)。AS-ASO-C及AS-ASO-CG在10%血清中孵育0.5 h即有大量降解,到4 h時(shí)已基本完全降解,提示嘧啶堿基極易被降解;AS-ASO-A、AS-ASO-G在4 h后有少許降解;AS-ASO-AA、AS-ASO-AG、AS-ASO-GA隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降解,而AS-ASO-GG在4 h后基本與開始時(shí)一致,無降解。結(jié)果提示,嘌呤RNA雙堿基可在血清中穩(wěn)定存在較長(zhǎng)時(shí)間。因此,若該RNA連接可在細(xì)胞內(nèi)被快速降解,則可作為理想的耦聯(lián)分子連接AS1411和效應(yīng)分子。

嵌合體分子在細(xì)胞裂解液中的穩(wěn)定性 進(jìn)一步分析AS-ASO-AA、AS-ASO-AG、AS-ASO-GG、AS-ASO-GA在細(xì)胞裂解液中的穩(wěn)定性。如圖3所示,上述嵌合體分子在20%細(xì)胞裂解液中孵育30 min即出現(xiàn)2條條帶,2 h后則大部分裂解,而4 h后幾乎完全裂解釋放ASO。結(jié)合血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明以腺嘌呤RNA雙堿基耦聯(lián)構(gòu)建的嵌合體分子可在血清中穩(wěn)定存在至少4 h,而進(jìn)入細(xì)胞后則在0.5 h內(nèi)即開始裂解釋放效應(yīng)分子。這提示以腺嘌呤RNA雙堿基耦聯(lián)構(gòu)建嵌合體分子可能介導(dǎo)靶向特異性而高效抗腫瘤。由于各嵌合體穩(wěn)定性無顯著差異,因此以gg (RAN)偶聯(lián)嵌合體進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 嵌合體分子在10%血清中的穩(wěn)定性

圖3 嵌合體分子在細(xì)胞裂解液中的穩(wěn)定性

嵌合體分子可高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞 為驗(yàn)證核仁素核酸適配體AS1411是否可有效介導(dǎo)ASO進(jìn)入細(xì)胞,以熒光染料FAM標(biāo)記ASO,首先通過流式細(xì)胞術(shù)予以驗(yàn)證。以FAM標(biāo)記的AS1411 (AS1411-FAM)為陽(yáng)性對(duì)照,以FAM標(biāo)記的效應(yīng)分子ASO (ASO-FAM)為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖4所示,陽(yáng)性對(duì)照組AS1411細(xì)胞FAM平均熒光強(qiáng)度值(mean fluorescence intensity,MFI) 顯著提高,是ASO-FAM組的1.44倍(P<0.01);嵌合體分子AS-ASO-GG組與陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果基本一致,是ASO-FAM組的1.33倍(P<0.01)。該結(jié)果說明AS1411耦聯(lián)的嵌合體分子可以高效介導(dǎo)寡核苷酸ASO進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

A:Results of positive control.The black curve showed ASO-FAM negative (control) and the red curve showed AS1411-FAM (positive control).B:Results of chimeric molecule.The black curve showed ASO-FAM (control) and the blue curve showed AS-ASO-GG-FAM (positive control).C:Statistical analysis of MFI.The MFI levels of AS1411 and AS-ASO-GG were higher than ASO-FAM (P<0.01).MFI:Mean fluorescence intensity.

圖4 嵌合分子的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

Fig 4 Results of chimeric molecules analyzed by flow cytometry

熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證嵌合體分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞為進(jìn)一步驗(yàn)證上述流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果,再次通過熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。同樣以AS1411-FAM和ASO-FAM為對(duì)照。圖5為共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果,其中藍(lán)色為核仁DAPI染色結(jié)果,綠色為FAM染色結(jié)果。由圖5可見,AS1411組綠色熒光多在細(xì)胞核中富集而胞質(zhì)中較少;AS-ASO-GG組則相反,胞質(zhì)中較多而核仁中較少;對(duì)照ASO組則基本無熒光。該結(jié)果提示AS1411高效結(jié)合核仁素,可介導(dǎo)耦聯(lián)的效應(yīng)分子高效進(jìn)入Du145細(xì)胞;AS-ASO-GG在胞質(zhì)中熒光強(qiáng)而核仁中弱,提示嵌合體分子進(jìn)入細(xì)胞后快速裂解而使ASO滯留在胞質(zhì)中。上述結(jié)果說明,以AS1411為靶向分子,通過雙嘌呤RNA堿基(GG)耦聯(lián)ASO嵌合體分子,可高效進(jìn)入靶細(xì)胞,并且在胞質(zhì)中釋放效應(yīng)分子ASO。

圖5 嵌合分子的共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果(400×)

AS-ASO-GG抑制細(xì)胞生長(zhǎng) 為驗(yàn)證構(gòu)建的嵌合體分子是否可以有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)以空白組為對(duì)照,通過CCK-8試劑盒檢測(cè)給藥24 h后450 nm處的D值,分析RNA雙堿基gg (RNA)耦聯(lián)AS1411和單獨(dú)AS1411在不同濃度下對(duì)Du145細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(圖6)。可見,單獨(dú)AS1411和空白對(duì)照組對(duì)Du145生長(zhǎng)無顯著影響;AS-ASO-GG嵌合體僅在5μmol/L時(shí)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),是單獨(dú)AS1411的68.0%,且顯著低于空白對(duì)照組。結(jié)果提示,耦聯(lián)ASO構(gòu)建的嵌合體分子在較高濃度下才能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),這可能與該ASO對(duì)STAT3沉默活性有限有關(guān)。

圖6 AS-ASO-GG抑制Du145細(xì)胞生長(zhǎng)

RT-PCR檢測(cè)AS-ASO-GG抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá) 為驗(yàn)證AS-ASO-GG (5μmol/L)是否有效抑制Du145細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá),以RT-PCR分析給藥48 h后,腫瘤相關(guān)基因Bcl-xl、CyclinD1、C-myc和PD-L1的mRNA相對(duì)水平。以單獨(dú)AS1411和空白為對(duì)照(圖7),mRNA相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于空白對(duì)照組,AS-ASO-GG組C-myc、CyclinD1、Bcl-xl、和PD-L1的mRNA相對(duì)水平分別下調(diào)66.2%、54.5%、49.8%和61.3% (P<0.05);而單獨(dú)AS1411無顯著差異。說明AS-ASO-GG可以有效抑制腫瘤相關(guān)基因表達(dá)。

圖7 AS-ASO-GG抑制腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

Western blot檢測(cè)AS-ASO-GG抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá) 為了進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證AS-ASO-GG (5μmol/L) 抑制Du145細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)情況,以Western blot分析給藥48 h后,腫瘤相關(guān)基因Bcl-xl、CyclinD1、C-myc和PD-L1的蛋白質(zhì)水平。以單獨(dú)AS1411和空白為對(duì)照(圖8),相對(duì)于空白組,AS-ASO-GG腫瘤相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平明顯下降,而單獨(dú)AS1411組則無明顯差異。這說明AS-ASO-GG可有效降低腫瘤相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平。

討 論

靶向特異性是當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要特征,尤其對(duì)于新型抗腫瘤治療藥物,更是先決條件。目前比較常用的治療方法中,缺乏特異性的化療、放療和手術(shù)治療常伴有嚴(yán)重的毒性作用和不良反應(yīng),嚴(yán)重破壞免疫系統(tǒng)功能,給患者帶來更大的痛苦[16]。因此開發(fā)具有靶向功能并特異性殺滅腫瘤細(xì)胞的藥物是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要方向。目前開發(fā)的新型抗腫瘤療法,如單克隆抗體藥物、CAR-T細(xì)胞等都顯著提高了其抗腫瘤治療靶向性,但也都存在一定的局限性,因此開發(fā)新的、靶向性更高的藥物迫在眉睫[1-2]。

圖8 AS-ASO-GG抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)

核酸適配體為單鏈DNA或RNA寡核苷酸,與目標(biāo)蛋白受體、多肽、胞內(nèi)生物大分子等具有高親和力、高特異性的結(jié)合[17-19]。相比于蛋白質(zhì)抗體,核酸適配體不但具有更高的親和力和靶向特異性[5],還具有如下顯著優(yōu)點(diǎn):(1)分子量小,在體內(nèi)更容易通過組織障礙到達(dá)病灶部位;(2)無免疫原性,不易刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體;(3)熱穩(wěn)定性強(qiáng),具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu);(4)可以方便快速大規(guī)模工業(yè)化合成;(5)生產(chǎn)成本低廉[5,17]。因此,核酸適配體是理想的精準(zhǔn)抗腫瘤治療藥物。尤其是核仁素核酸適配體AS1411,可高特異性、高親和力結(jié)合癌細(xì)胞表面的核仁素而對(duì)正常細(xì)胞無親和力,是十分理想的抗腫瘤藥物靶向分子[6-9]。

目前核仁素核酸適配體AS1411已經(jīng)在抗腫瘤研究中獲得廣泛應(yīng)用,主要包括作為阻斷劑直接抗腫瘤治療和作為載體介導(dǎo)藥物靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。作為載體是AS1411更重要的作用,也是目前靶向抗腫瘤研究的重點(diǎn)手段,但各方法均存在一定的缺陷。Oh等[20]利用點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)以PEG將阿霉素耦聯(lián)至AS1411,從而靶向并有效減少藥物毒性作用和不良反應(yīng),但該方法僅限于含有羧基結(jié)構(gòu)的特殊藥物。利用核酸適配體AS1411耦聯(lián)納米顆粒或脂質(zhì)體,可增加靶向性、提高裝載藥物的抗腫瘤活性并降低毒性作用和不良反應(yīng),表現(xiàn)出更強(qiáng)的靶向特異性殺傷腫瘤效果[21-22],但這同時(shí)加劇了脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性,且其靶向性依然欠佳。采用堿基互補(bǔ)配對(duì)是構(gòu)建AS1411嵌合體的另一種方式。Subramanian等[23]利用該原理將存活蛋白脫氧核酶耦聯(lián)至AS1411,實(shí)現(xiàn)了特異性靶向藥物投遞,但活性不佳,并且以該方法構(gòu)建的嵌合體熱穩(wěn)定性很差,依然具有免疫原性等不足。

本研究設(shè)計(jì)的AS1411-RNA-ASO嵌合體分子,以AS1411為靶向分子,利用RNA堿基耦聯(lián)效應(yīng)分子ASO,從而使ASO能夠靶向進(jìn)入核仁素陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以RNA雙堿基gg耦聯(lián)的嵌合體分子可在血清中較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在,而在胞質(zhì)中快速分解釋放耦聯(lián)的效應(yīng)分子。熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明,AS1411可快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并在核仁富集,而絕大部分熒光標(biāo)記的效應(yīng)分子卻滯留在胞質(zhì)中,說明嵌合體分子進(jìn)入細(xì)胞后可迅速釋放耦聯(lián)的效應(yīng)分子。進(jìn)一步的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)表明,嵌合體分子 AS-ASO-GG可有效抑制Du145細(xì)胞生長(zhǎng),并抑制Bcl-xL、CyclinD1、C-myc和PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。

本研究利用AS1411介導(dǎo)STAT3 ASO靶向給藥,可顯著提高藥物投遞效率,尤其是STAT3 ASO具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。相比于其他方法,以RNA堿基耦聯(lián)AS1411和STAT3 ASO構(gòu)建的嵌合分子具有腫瘤靶向性強(qiáng)、活性高、穩(wěn)定強(qiáng)、進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后起效快的特點(diǎn)。且由于AS1411和STAT3 ASO本身均為核酸類小分子抗腫瘤藥物,而對(duì)正常細(xì)胞無顯著的毒性作用[18,24],因此構(gòu)建的嵌合體分子還具有低毒性作用、弱免疫原性及適合長(zhǎng)期給藥等優(yōu)勢(shì)。

綜上所述,以RNA雙嘌呤堿基(gg)耦聯(lián)核仁素核酸適配體AS1411和ASO構(gòu)建的嵌合體分子可高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,并在細(xì)胞中快速釋放ASO。其中AS-ASO-GG嵌合體可顯著下調(diào)Bcl-xL、CyclinD1、C-myc和PD-L1的mRNA和蛋白質(zhì)水平并抑制Du145細(xì)胞生長(zhǎng),為進(jìn)一步的精準(zhǔn)抗腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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A preliminary study of AS1411 mediated STAT3 antisense oligonucleotide targeting tumor cells

LIU Bao-xiu, HUANG Jian-sheng, ZHU Nai-shuo△

(LaboratoryofMolecularInfectionandImmunology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Objective To observe the effect of AS1411-mediated signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) antisense oligonucleotide (ASO) targeting tumor cells. Methods RNA was used as coupling molecules to link the targeting molecules AS1411 and effector molecules ASO.Prediction and analysis of the secondary structure of the pre-synthesis of chimeric molecules by RNA Structure software.Agarose gel electrophoresis was used to test the stability of chimeric molecules in serum and cell lysis solution.Using flow cytometry and confocal fluorescence microscope were used to estimate the internalization of AS1411-mediated STAT3 ASO.Inhibitory effect of ASO on the growth of tumor cells was detected by CCK-8 kit.RT-PCR and Western blot was used to measure the expression levels of tumor related genes.Results STAT3 ASOs mediated by AS1411 can enter tumor cells efficiently to inhibit the transcription and translation ofC-myc,CyclinD1,Bcl-xlandPD-L1 gene,and also can inhibit the growth of Du145 cells. Conclusions AS1411-mediated STAT3 ASO can enter tumor cells and act as anti-tumor medicine.

antisense oligonucleotide; AS1411; anti-tumor; targeting

國(guó)家自然科學(xué)基金(30901315,30970144);國(guó)家863計(jì)劃重大課題(2011AA02A114);上海市科委支撐項(xiàng)目(13431900602)

R73-36

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.005

2016-10-31;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:nzhu@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30901315,30970144),the National High Technology Research and Development Program of China (2011AA02A114) and the Project Supported by Shanghai Committee of Science and Technology (13431900602).