馬建蘋，康銀霞，郭 濤，李善家，晉 玲

（1蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050；2甘肅省中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州理工大學(xué)，蘭州 730050；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000）

貝加爾唐松草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性研究

馬建蘋*，康銀霞1,2，郭 濤1,2，李善家1，晉 玲3

（1蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050；2甘肅省中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州理工大學(xué)，蘭州 730050；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000）

目的 研究貝加爾唐松草植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性。方法 用微量肉湯稀釋法測(cè)定貝加爾唐松草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的最低抑菌濃度(MICs)。結(jié)果18株內(nèi)生真菌的乙醇提取物、乙酸乙酯和正丁醇萃取物中，Z-1的乙酸乙酯部位抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌的MIC值為125μg/mL，對(duì)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌的MIC值均為250μg/mL，菌株Z-3和Z-4的正丁醇部位抑菌活性較好，對(duì)6株供試菌的MIC值都達(dá)到250μg/mL；乙醇部位抑菌活性較弱。結(jié)論 貝加爾唐松草內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抑菌活性，為進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

貝加爾唐松草；內(nèi)生真菌；次級(jí)代謝產(chǎn)物；抑菌活性

貝加爾唐松草(Thalictrum baicalense Turcz)為毛茛科(Ranunculaceae)唐松草屬(Thalictrum)植物，多年生草本植物，別名馬尾黃連、土黃連等。以根及根莖入藥，有抗菌消炎、清熱燥濕、涼血解毒、清心除煩之功效，具有抗癌、降壓、利尿、抗心律失常等藥理作用，主要用于治療痢疾、腸炎、濕熱黃疸、傳染性肝炎、咽喉腫痛、瘡癤、腳癬等癥[1-2]。據(jù)研究報(bào)道，藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物可以產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，對(duì)多種病原微生物具有一定的抑制活性，約有30%的內(nèi)生真菌具有抗細(xì)菌和抗真菌活性[3]，有望成為臨床抗菌類藥物和研究與開發(fā)生物農(nóng)藥的新資源。如Dai[4]等從刺柏屬植物雪松(Juniperuscedre)中分離得到多節(jié)孢屬(Nodulisporium sp)內(nèi)生真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯部位共分離得到17種化合物，其中的12種化合物均表現(xiàn)出了很好的抗真菌和細(xì)菌活性。有研究表明唐松草屬植物生物堿具有抗菌活性[5]，但關(guān)于貝加爾唐松草內(nèi)生真菌的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道，鑒于藥用植物及其內(nèi)生真菌的重要價(jià)值，本研究對(duì)貝加爾唐松草內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究。

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)所用18株植物內(nèi)生真菌均由本研究室提供。紫外分光光度計(jì)、電子分析天平、電熱恒溫干燥箱、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、實(shí)驗(yàn)型高壓滅菌鍋等均為常用儀器；實(shí)驗(yàn)所用藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 供試菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)及供試樣品的制備

將保存于斜面培養(yǎng)基中的內(nèi)生真菌菌株挑取少許在培養(yǎng)基平板上畫線活化1～2次，活化好的菌株挑取適量接種于液體培養(yǎng)基中，28℃、160r/min培養(yǎng)7d，待菌株成熟后，液體培養(yǎng)基用布氏漏斗抽濾，分別得到濾液和菌絲體。濾液加入等體積的乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，各萃取3次，合并每次萃取液，減壓蒸干，得到發(fā)酵液乙酸乙酯和正丁醇萃取部位；固體菌絲冷凍干燥后用乙醇回流提取，回流2～3h，提取液減壓蒸干得菌絲乙醇提取部位。

2.2 MIC值測(cè)定

精確稱量待測(cè)樣品6.0mg，加入150μL的DMSO充分溶解，再加入1350μL的MH肉湯，使樣品的最初濃度為4000μg/mL，然后采用二倍稀釋法，用MH肉湯依次稀釋成濃度為2000，1000，500，250，125μg/mL的樣品備用。在96孔平底微孔板中依次加入100μL的MH肉湯，50μL梯度稀釋的樣品，50μL0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?，使待測(cè)樣品的終濃度分別為1000，500，250，125，62.5，31.25μg/mL[5-6]。陰性對(duì)照組用50μL1%DMSO的肉湯培養(yǎng)基，陽性對(duì)照為50μL20μg/mL硫酸鏈霉素。37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12-18h，然后每孔加入50μL100μg/mL INT（碘硝基四唑紫）顯色劑，30min后觀察顏色變化，以沒有顯示紅色的最低濃度作為該樣品對(duì)某一細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)。

3.結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對(duì)貝加爾唐松草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定和篩選，陽性對(duì)照硫酸鏈霉素在20μg/mL時(shí)對(duì)所有供試菌都有抑制活性，陰性對(duì)照組樣品均顯紅色，表明抑菌試驗(yàn)?zāi)Ｐ土己茫幸志钚缘臉悠方Y(jié)果見表1。從表1可以看出，菌株Z-1的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，對(duì)金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌的MIC值為125μg/mL，對(duì)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌的MIC值均為250μg/mL；菌株Z-3和Z-4的正丁醇部位抑菌活性較好，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的MIC值都達(dá)到250μg/mL；菌株Z-7乙醇部位抑菌活性較好，其對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的MIC值都達(dá)到250μg/mL、對(duì)無乳鏈球菌、地衣芽孢桿菌的MIC值為1000μg/mL，其他菌株活性整體較弱或者在樣品濃度在1000μg/mL時(shí)無明顯抑菌活性。

表1 貝加爾唐松草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的最低抑菌濃度(MIC,μg/mL)

注：G-根；Y-葉；J-莖；Z-種子；a-乙酸乙酯；b-正丁醇；c-乙醇

4.結(jié)論

目前，雖然有多種方法檢測(cè)樣品的抗菌活性，但不同方法存在靈敏性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性等差異，沒有一個(gè)絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)，陳秀樞等對(duì)微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC值進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明傳統(tǒng)瓊脂稀釋法和試管肉湯稀釋法既煩瑣，準(zhǔn)確度又不高，一直難以將其作為常規(guī)藥敏試驗(yàn)，臨床廣泛采用的是對(duì)MIC范圍作定性解釋的紙片擴(kuò)散法，然而該法又不可避免地存在許多局限性，如受到菌厚度和培養(yǎng)基厚度的影響等，實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性相應(yīng)受到影響，因此，具有簡便性和良好的方法學(xué)性能的微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC值，具有臨床推廣應(yīng)用價(jià)值，更適于檢測(cè)樣品的抗菌活性。Eloff[8]等對(duì)微量肉湯稀釋法進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)使用96孔微量培養(yǎng)板，并用INT（碘硝基四唑紫）顯色劑來說明細(xì)菌的生長狀況，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的靈敏性和可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對(duì)貝加爾唐松草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性分析，抑菌活性物質(zhì)主要集中于發(fā)酵液的乙酸乙酯部位。Z-1發(fā)酵液的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，其對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌、地衣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均有抑制活性。發(fā)酵液正丁醇部位和菌絲體乙醇提取部位抑菌活性較弱，大多數(shù)樣品在1000μg/mL時(shí)，對(duì)所有菌株沒有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。后續(xù)將進(jìn)一步闡明其抑菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為當(dāng)?shù)厮幱弥参镔Y源的綜合開發(fā)利用提供理論支撐。

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甘肅省自然科學(xué)基金（No.1606RJZA207）