何欽1，李星陸2，周瑾1

（西北師范大學(xué)附屬中學(xué)，蘭州一中）

4株引起饅頭腐敗變質(zhì)細(xì)菌的分離和鑒定

何欽1，李星陸2，周瑾1

（西北師范大學(xué)附屬中學(xué)，蘭州一中）

圍繞生物課程“神奇的微生物”、“生態(tài)系統(tǒng)”和“食品保存”等內(nèi)容展開(kāi)，以現(xiàn)實(shí)生活中變質(zhì)饅頭為研究對(duì)象，通過(guò)探究引起變質(zhì)的原因，進(jìn)而認(rèn)識(shí)微生態(tài)環(huán)境下生長(zhǎng)的奇妙微生物群落。以變質(zhì)饅頭表面微生物為研究對(duì)象，采用富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和畫(huà)線(xiàn)分離等技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行了分離純化，并對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，從變質(zhì)饅頭表面共分離獲得4株細(xì)菌，綜合微生物特征和生理生化特性結(jié)果判定N1、N2和N3屬于芽孢桿菌，N4屬于莢膜菌。

隨著人們對(duì)微生物[1]認(rèn)識(shí)的不斷深入，微生物已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。微生物在食品工業(yè)生產(chǎn)中既有利又有害，有利的方面如酵母菌可制面包、酒；霉菌可制豆醬、醬油；乳酸菌可制泡菜、酸奶等[2]；有害的方面主要表現(xiàn)在會(huì)使食品變質(zhì)，如制面包時(shí)，若不用高溫充分烘烤，其中的芽孢桿菌就會(huì)大量繁殖使面包變味；制泡菜時(shí)，若溫度過(guò)高，丁酶菌迅速生長(zhǎng)繁殖會(huì)帶來(lái)腐臭等異味。本文就日常生活中的變質(zhì)饅頭表面微生物為研究對(duì)象，采用富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和畫(huà)線(xiàn)分離等技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行了分離純化，并對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行了分析。

1 、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料：霉變的饅頭

試劑：重鉻酸鉀、瓊脂、甘露醇、酵母粉、瓊脂粉、磷酸氫二鉀等購(gòu)自煙臺(tái)雙雙化工試劑廠(chǎng)，均為分析純。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；檸檬酸鹽培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基參照沈萍編著的《微生物試驗(yàn)指導(dǎo)》進(jìn)行配制。

主要儀器：超凈工作臺(tái)、數(shù)碼成像顯微鏡（MOTIC）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的收集

輕輕地將變質(zhì)饅頭表皮撕下來(lái)，浸泡在50mL無(wú)菌水中，制成菌懸液，備用。

1.2.2 微生物的富集培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌狀態(tài)下，從菌懸液中分別吸取1.0 mL至50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)16～24h。

1.2.3 微生物的分離和純化

分別取出經(jīng)富集培養(yǎng)的微生物菌懸液，采用畫(huà)線(xiàn)分離法分別在細(xì)菌分離固體培養(yǎng)基上畫(huà)線(xiàn)分離，培養(yǎng)。如此反復(fù)幾次，觀(guān)察微生物菌落形態(tài)，將認(rèn)為是純種的微生物進(jìn)行菌株保藏。

1.2.4 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

參照細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定。

2 、結(jié)果與討論

2.1 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的分離、純化和生理特性

2.1.1 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的菌落形態(tài)

對(duì)變質(zhì)饅頭進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化，按照微生物生長(zhǎng)菌落形態(tài)差異，獲得4株具有一定生長(zhǎng)差異的細(xì)菌，分別命名為N1，N2，N3和N4。菌落形態(tài)如圖1，各菌落形態(tài)描述結(jié)果如表1，從圖1和表1中可以看出不同細(xì)菌生長(zhǎng)速度有所差異，菌落大小各異，其中N3生長(zhǎng)速度最快，N2最慢；菌落都是圓形，除了N4外其他菌株邊緣光滑；N1表面干燥。

編號(hào) N 1 N 2 N 3 N 4細(xì)菌

圖1 變質(zhì)饅頭中分離獲得細(xì)菌菌落形態(tài)結(jié)果

表1 4株細(xì)菌菌落形態(tài)描述結(jié)果

2.1.2 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的顯微形態(tài)特征

根據(jù)細(xì)菌的顯微鑒定和觀(guān)察方法，分別采用革蘭氏染色和芽孢染色對(duì)分離的4株菌株進(jìn)行染色，制片，結(jié)果如圖2。在10×40放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下4種細(xì)菌中N1、N2、N3顯微結(jié)果中既有芽孢也有營(yíng)養(yǎng)體，而且芽孢呈綠色，營(yíng)養(yǎng)體呈紅色，進(jìn)一步說(shuō)明三株菌產(chǎn)芽孢，N4不產(chǎn)芽孢，N1、N2為革蘭氏陽(yáng)性菌，N3、N4為革蘭氏陰性菌， N1、N2、N3和N4的細(xì)胞形態(tài)為桿狀。

圖2 4株菌株芽孢染色和革蘭氏染色結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀(guān)察結(jié)果（×40）

2.1.3 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的生理生化特性

分別對(duì)4株細(xì)菌進(jìn)行了V.P.試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)。結(jié)果顯示，除N3菌甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性外，N1、N2、N4都為陰性，并且4株菌的伏-普試驗(yàn)都為陽(yáng)性。由此說(shuō)明，N4不能利用葡萄糖，N1、N2和N3都能發(fā)酵利用葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，由于糖代謝的途徑不同，可能會(huì)產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。進(jìn)一步通過(guò)V.P.試驗(yàn)說(shuō)明，四株菌株在糖代謝過(guò)程中，可以分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)而丙酮酸通過(guò)縮合和脫羧生成3-羥基丁酮，被還原成2,3-丁二醇，3-羥基丁酮在堿性條件下，可被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基里蛋白胨中的胍基作用，生成紅色化合物，由此表現(xiàn)為陽(yáng)性。4株菌的檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為陰性。由此說(shuō)明N1和N3菌株能以檸檬酸鈉為碳源，并分解檸檬酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。

2.1.4 引起饅頭變質(zhì)細(xì)菌的主要菌群

通過(guò)對(duì)變質(zhì)饅頭細(xì)菌的分離純化、菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征的觀(guān)察并結(jié)合生理生化試驗(yàn)，各試驗(yàn)反應(yīng)現(xiàn)象如表2，對(duì)照細(xì)菌鑒定手冊(cè)初步確定變質(zhì)饅頭表面細(xì)菌主要為芽孢桿菌和莢膜菌，N1、N2和N3屬于芽孢桿菌，N4屬于莢膜菌。

表2 4株細(xì)菌的生理生化結(jié)果

3 、結(jié)論

通過(guò)對(duì)變質(zhì)饅頭表面細(xì)菌進(jìn)行了分離、純化、生理生化試驗(yàn)鑒定，初步確定了本研究中放置于冰箱中的變質(zhì)饅頭表面滋生的4株細(xì)菌主要是芽孢桿菌和莢膜菌。

[1]劉正雄，等.中華小百科全書(shū)·生物卷，四川: 四川教育出版社，1994

[2]蔡信之，等.微生物學(xué).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996