何欽1,李星陸2,周瑾1
(西北師范大學(xué)附屬中學(xué),蘭州一中)
4株引起饅頭腐敗變質(zhì)細(xì)菌的分離和鑒定
何欽1,李星陸2,周瑾1
(西北師范大學(xué)附屬中學(xué),蘭州一中)
圍繞生物課程“神奇的微生物”、“生態(tài)系統(tǒng)”和“食品保存”等內(nèi)容展開(kāi),以現(xiàn)實(shí)生活中變質(zhì)饅頭為研究對(duì)象,通過(guò)探究引起變質(zhì)的原因,進(jìn)而認(rèn)識(shí)微生態(tài)環(huán)境下生長(zhǎng)的奇妙微生物群落。以變質(zhì)饅頭表面微生物為研究對(duì)象,采用富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和畫(huà)線(xiàn)分離等技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行了分離純化,并對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,從變質(zhì)饅頭表面共分離獲得4株細(xì)菌,綜合微生物特征和生理生化特性結(jié)果判定N1、N2和N3屬于芽孢桿菌,N4屬于莢膜菌。
隨著人們對(duì)微生物[1]認(rèn)識(shí)的不斷深入,微生物已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。微生物在食品工業(yè)生產(chǎn)中既有利又有害,有利的方面如酵母菌可制面包、酒;霉菌可制豆醬、醬油;乳酸菌可制泡菜、酸奶等[2];有害的方面主要表現(xiàn)在會(huì)使食品變質(zhì),如制面包時(shí),若不用高溫充分烘烤,其中的芽孢桿菌就會(huì)大量繁殖使面包變味;制泡菜時(shí),若溫度過(guò)高,丁酶菌迅速生長(zhǎng)繁殖會(huì)帶來(lái)腐臭等異味。本文就日常生活中的變質(zhì)饅頭表面微生物為研究對(duì)象,采用富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和畫(huà)線(xiàn)分離等技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行了分離純化,并對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行了分析。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
材料:霉變的饅頭
試劑:重鉻酸鉀、瓊脂、甘露醇、酵母粉、瓊脂粉、磷酸氫二鉀等購(gòu)自煙臺(tái)雙雙化工試劑廠(chǎng),均為分析純。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;檸檬酸鹽培養(yǎng)基,以上培養(yǎng)基參照沈萍編著的《微生物試驗(yàn)指導(dǎo)》進(jìn)行配制。
主要儀器:超凈工作臺(tái)、數(shù)碼成像顯微鏡(MOTIC)等。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣品的收集
輕輕地將變質(zhì)饅頭表皮撕下來(lái),浸泡在50mL無(wú)菌水中,制成菌懸液,備用。
1.2.2 微生物的富集培養(yǎng)
在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌狀態(tài)下,從菌懸液中分別吸取1.0 mL至50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)16~24h。
1.2.3 微生物的分離和純化
分別取出經(jīng)富集培養(yǎng)的微生物菌懸液,采用畫(huà)線(xiàn)分離法分別在細(xì)菌分離固體培養(yǎng)基上畫(huà)線(xiàn)分離,培養(yǎng)。如此反復(fù)幾次,觀(guān)察微生物菌落形態(tài),將認(rèn)為是純種的微生物進(jìn)行菌株保藏。
1.2.4 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定
參照細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定。
2.1 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的分離、純化和生理特性
2.1.1 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的菌落形態(tài)
對(duì)變質(zhì)饅頭進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化,按照微生物生長(zhǎng)菌落形態(tài)差異,獲得4株具有一定生長(zhǎng)差異的細(xì)菌,分別命名為N1,N2,N3和N4。菌落形態(tài)如圖1,各菌落形態(tài)描述結(jié)果如表1,從圖1和表1中可以看出不同細(xì)菌生長(zhǎng)速度有所差異,菌落大小各異,其中N3生長(zhǎng)速度最快,N2最慢;菌落都是圓形,除了N4外其他菌株邊緣光滑;N1表面干燥。
編號(hào) N 1 N 2 N 3 N 4細(xì)菌
圖1 變質(zhì)饅頭中分離獲得細(xì)菌菌落形態(tài)結(jié)果
表1 4株細(xì)菌菌落形態(tài)描述結(jié)果
2.1.2 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的顯微形態(tài)特征
根據(jù)細(xì)菌的顯微鑒定和觀(guān)察方法,分別采用革蘭氏染色和芽孢染色對(duì)分離的4株菌株進(jìn)行染色,制片,結(jié)果如圖2。在10×40放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下4種細(xì)菌中N1、N2、N3顯微結(jié)果中既有芽孢也有營(yíng)養(yǎng)體,而且芽孢呈綠色,營(yíng)養(yǎng)體呈紅色,進(jìn)一步說(shuō)明三株菌產(chǎn)芽孢,N4不產(chǎn)芽孢,N1、N2為革蘭氏陽(yáng)性菌,N3、N4為革蘭氏陰性菌, N1、N2、N3和N4的細(xì)胞形態(tài)為桿狀。
圖2 4株菌株芽孢染色和革蘭氏染色結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀(guān)察結(jié)果(×40)
2.1.3 變質(zhì)饅頭細(xì)菌的生理生化特性
分別對(duì)4株細(xì)菌進(jìn)行了V.P.試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)。結(jié)果顯示,除N3菌甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性外,N1、N2、N4都為陰性,并且4株菌的伏-普試驗(yàn)都為陽(yáng)性。由此說(shuō)明,N4不能利用葡萄糖,N1、N2和N3都能發(fā)酵利用葡萄糖,產(chǎn)生丙酮酸,由于糖代謝的途徑不同,可能會(huì)產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。進(jìn)一步通過(guò)V.P.試驗(yàn)說(shuō)明,四株菌株在糖代謝過(guò)程中,可以分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)而丙酮酸通過(guò)縮合和脫羧生成3-羥基丁酮,被還原成2,3-丁二醇,3-羥基丁酮在堿性條件下,可被空氣中的氧氣氧化成二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基里蛋白胨中的胍基作用,生成紅色化合物,由此表現(xiàn)為陽(yáng)性。4株菌的檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為陰性。由此說(shuō)明N1和N3菌株能以檸檬酸鈉為碳源,并分解檸檬酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。
2.1.4 引起饅頭變質(zhì)細(xì)菌的主要菌群
通過(guò)對(duì)變質(zhì)饅頭細(xì)菌的分離純化、菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征的觀(guān)察并結(jié)合生理生化試驗(yàn),各試驗(yàn)反應(yīng)現(xiàn)象如表2,對(duì)照細(xì)菌鑒定手冊(cè)初步確定變質(zhì)饅頭表面細(xì)菌主要為芽孢桿菌和莢膜菌,N1、N2和N3屬于芽孢桿菌,N4屬于莢膜菌。
表2 4株細(xì)菌的生理生化結(jié)果
通過(guò)對(duì)變質(zhì)饅頭表面細(xì)菌進(jìn)行了分離、純化、生理生化試驗(yàn)鑒定,初步確定了本研究中放置于冰箱中的變質(zhì)饅頭表面滋生的4株細(xì)菌主要是芽孢桿菌和莢膜菌。
[1]劉正雄,等.中華小百科全書(shū)·生物卷,四川: 四川教育出版社,1994
[2]蔡信之,等.微生物學(xué).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1996