趙明娟

(北京市懷柔區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京懷柔101400)

反復(fù)凍融對(duì)血清樣品中三型口蹄疫免疫抗體效價(jià)的影響

趙明娟

(北京市懷柔區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京懷柔101400)

為了研究反復(fù)凍融對(duì)血清樣品中免疫抗體效價(jià)的影響，隨機(jī)采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行過(guò)多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，采用液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測(cè)其中口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體的效價(jià)。每份樣品檢測(cè)4次，檢測(cè)時(shí)間分別為采樣后、反復(fù)凍融1次后、反復(fù)凍融2次后、反復(fù)凍融3次后。冷凍條件為-20℃冷凍24 h，融解溫度為25 ℃。統(tǒng)計(jì)分析樣品4次檢測(cè)的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價(jià)變化，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果顯示，采樣后、反復(fù)凍融1次、反復(fù)凍融2次、反復(fù)凍融3次所測(cè)得的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價(jià)差異均不顯著，表明反復(fù)凍融3次以內(nèi)不會(huì)影響血清樣品中免疫抗體效價(jià)。

反復(fù)凍融 ； 血清樣品 ； 免疫抗體效價(jià)

畜禽免疫抗體監(jiān)測(cè)是畜禽重大動(dòng)物疫病防控工作的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)免疫抗體監(jiān)測(cè)，不僅可以直接有效地反映畜禽體內(nèi)免疫抗體水平，評(píng)估疫苗免疫質(zhì)量和效價(jià)，制定科學(xué)的免疫程序[1]，同時(shí)也為動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠依據(jù)，根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果及時(shí)對(duì)不合格場(chǎng)戶進(jìn)行補(bǔ)免，預(yù)防群體發(fā)病，降低疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，保障養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益[2]。

作為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員，正確地保存和處理送檢樣品、嚴(yán)格地試驗(yàn)操作都是確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件[3]。根據(jù)《2015年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》，每種送檢動(dòng)物血清樣品的抗體檢測(cè)項(xiàng)目也包括3種以上，例如豬血清樣品需檢測(cè)的免疫抗體項(xiàng)目包括豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病、口蹄疫O型等，奶牛血清樣品需檢測(cè)口蹄疫O型、亞洲1型、A型等，雞血清樣品需檢測(cè)高致病性禽流感H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、新城疫等。在基層實(shí)驗(yàn)室，由于人力和設(shè)備的不足，很難一次完成所有項(xiàng)目的檢測(cè)工作，待檢血清樣品反復(fù)凍融在所難免。

本試驗(yàn)通過(guò)研究反復(fù)凍融3次的奶牛血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價(jià)的變化，進(jìn)一步揭示反復(fù)凍融血清樣品對(duì)其中抗體效價(jià)會(huì)產(chǎn)生何種影響，以期為廣大實(shí)驗(yàn)室工作人員合理安排免疫抗體檢測(cè)試驗(yàn)提供參考，確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及有效性。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品隨機(jī)采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行過(guò)多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，所使用的口蹄疫三價(jià)滅活疫苗由金宇寶靈生物藥品有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)樣品采集后，未經(jīng)冷凍，第1次檢測(cè)其中三型口蹄疫的免疫抗體效價(jià)，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃ 第1次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第2次檢測(cè)其中三型口蹄疫的免疫抗體效價(jià)，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃第 2次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第3次檢測(cè)其中三型口蹄疫的免疫抗體效價(jià)，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃ 第3次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第4次檢測(cè)其中三型口蹄疫的免疫抗體效價(jià)，記錄結(jié)果。

1.3 試驗(yàn)試劑口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)20151027103-1，抗原批號(hào)15081003，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫亞洲1型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)20150901102-1，抗原批號(hào)14122402，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)20151016101-7，抗原批號(hào)15080401，抗原使用濃度1∶15。

1.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備30～300 μL 12道移液器，5～50 μL 12道移液器，5～50 μL 單道移液器，1～10 mL 單道移液器，生產(chǎn)廠家均為T(mén)hermo。電熱恒溫培養(yǎng)箱，生產(chǎn)廠家Boxun，型號(hào)BPX-162。純水儀，生產(chǎn)廠家HITECH，型號(hào)Master-S。自動(dòng)洗板機(jī)，生產(chǎn)廠家BioTek，型號(hào)405LSRS。酶標(biāo)儀，生產(chǎn)廠家Thermo，型號(hào)MULTISKAN MK3。

1.5 試驗(yàn)方法，血清樣品三型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)均采用液相阻斷ELISA方法開(kāi)展，試驗(yàn)嚴(yán)格按照GB/T18935-2003口蹄疫診斷技術(shù)和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)4組試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究其差異顯著性。

2 試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 三型口蹄疫免疫抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果及分析統(tǒng)計(jì)

2.1 三型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果分析 通過(guò)觀察與實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)，每份樣品4次檢測(cè)的三型口蹄疫免疫抗體效價(jià)基本一致，偶爾有個(gè)別效價(jià)出現(xiàn)偏差，并未呈現(xiàn)規(guī)律性下降，分析原因可能是由于試驗(yàn)誤差所致。

50份樣品4次檢測(cè)的三型口蹄疫免疫抗體效價(jià)平均值變化不大，相差在一個(gè)滴度內(nèi)。

2.2 三型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果差異顯著性分析 采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，三型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果P值均大于0.05，差異不顯著，表明反復(fù)凍融3次以內(nèi)不會(huì)造成待檢血清樣品中的三型口蹄疫免疫抗體效價(jià)產(chǎn)生變化。

3 討論

3.1 鐘錦輝(2013)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，多次凍融不會(huì)造成血清豬瘟抗體效價(jià)的顯著降低[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，反復(fù)凍融3次以內(nèi)不會(huì)對(duì)血清樣品中的口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價(jià)造成影響。在實(shí)驗(yàn)室人員和設(shè)備不足的情況下，將送檢樣品適當(dāng)凍融不會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的偏差，仍然具有可信度。值得注意的是，融解血清樣品的溫度不宜太高，本試驗(yàn)選擇的是25 ℃，屬于一般試驗(yàn)反應(yīng)的正常溫度，若融解溫度高于37 ℃，可能引起樣品變質(zhì)，造成抗體效價(jià)降低。

3.2 疫苗免疫屬于人工主動(dòng)免疫，在畜禽體內(nèi)產(chǎn)生的抗體主要成分為免疫球蛋白IgG。IgG在動(dòng)物體內(nèi)含量高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，具有抗菌、中和病毒和毒素等免疫學(xué)活性，是畜禽機(jī)體內(nèi)抗感染免疫的主力，也是血清學(xué)診斷和疫苗免疫后監(jiān)測(cè)的主要抗體。由于免疫球蛋白屬于大分子蛋白質(zhì)，引起待檢血清中免疫抗體效價(jià)降低的原因，可能是抗體在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，即蛋白質(zhì)發(fā)生變質(zhì)。引起蛋白質(zhì)變性的原因包括物理因素和化學(xué)因素兩類(lèi)。物理因素有加熱、振蕩、紫外線照射、超聲波作用等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等。冷凍屬于低溫因素，并不是引起蛋白質(zhì)變性的主要因素。有研究顯示，血清樣品，在2 ℃～8 ℃的冰箱中，可保存15 d，-15 ℃以下冷凍可保存2年[5]，因此，少次的反復(fù)凍融并不會(huì)對(duì)待檢血清樣品中的免疫抗體效價(jià)產(chǎn)生影響。

3.3 根據(jù)北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心發(fā)布的《關(guān)于做好2016年動(dòng)物防疫工作的通知》(京疫控〔2016〕16號(hào))2016年北京市強(qiáng)制免疫動(dòng)物疫病種類(lèi)有7種，包括高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病、豬瘟、狂犬病、小反芻獸疫和羊布魯菌??；根據(jù)《2016年北京市動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃實(shí)施方案》(京疫控〔2016〕15號(hào))2016年動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)種類(lèi)包括免疫抗體檢測(cè)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)兩大類(lèi)。根據(jù)文件要求，每份待檢血清樣品檢測(cè)項(xiàng)目都在5項(xiàng)左右，不需要反復(fù)凍融多次。本試驗(yàn)從實(shí)際出發(fā)，本著應(yīng)用性強(qiáng)的原則，只研究了反復(fù)凍融3次以內(nèi)血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價(jià)的變化情況，結(jié)果顯示不受影響，但并不表明多次反復(fù)凍融不會(huì)導(dǎo)致血清樣品中抗體效價(jià)降低，具體影響如何還有待進(jìn)一步研究。

3.4 本試驗(yàn)只研究了反復(fù)凍融3次以內(nèi)對(duì)待檢血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價(jià)不會(huì)產(chǎn)生影響，在工作實(shí)踐中，一份待檢血清樣品需要檢測(cè)多種抗體效價(jià)的情況還包括豬、羊、犬、雞、鴨、鵝等畜禽的血清樣品。由于抗體的成分都是免疫球蛋白，其生物學(xué)特性基本相似，推斷此試驗(yàn)的結(jié)論也應(yīng)該適用于其他抗體檢測(cè)試驗(yàn)，實(shí)際如何有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 劉永波，宋春蓮，謝相悅，等.云南4 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟抗體水平監(jiān)測(cè)及免疫效果分析[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2017，1: 84-86.

[2] 馬 琪，韓冬林. 畜禽免疫抗體監(jiān)測(cè)工作存在的問(wèn)題及對(duì)策[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2011，12: 195.

[3] 田肖，紀(jì)高華，任友安. 影響動(dòng)物免疫抗體檢測(cè)結(jié)果的因素分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)，2017，38(1): 39-40.

[4] 鐘錦輝，張海明，段曉冬，等. 血清凍融次數(shù)對(duì)豬瘟抗體效價(jià)的影響[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技 ，2013，38(1): 17-19.

[5] 羅承金. 畜禽免疫抗體監(jiān)測(cè)血樣采集與血清分離保存技術(shù)[J]. 山東畜牧獸醫(yī) ，2012，33(2): 48-49.

2016-12-31

趙明娟(1981-)，女，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)和檢測(cè)研究，E-mail: zmj168_ren@163.com

S852.5

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0529-6005(2017)07-0095-02