張竹青， 盧書明， 王花麗， 徐夢(mèng)杳， 李春艷， 辛 悅， 趙俊軍

(1 大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033；2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a. 消化內(nèi)科；b. 病理科，遼寧 大連 116011)

microRNA-222在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

張竹青1， 盧書明2a， 王花麗2b， 徐夢(mèng)杳2a， 李春艷2a， 辛 悅1， 趙俊軍1

(1 大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033；2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a. 消化內(nèi)科；b. 病理科，遼寧 大連 116011)

目的 檢測(cè)microRNA-222(miRNA-222)在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。方法 收集2012年1月-2014年12月于大連市中心醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的HCC組織103例，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)HCC、近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中miRNA-222的表達(dá)水平，分析miRNA-222表達(dá)與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett′s T3法；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.167，P<0.001)，其在HCC組織中的相對(duì)表達(dá)量(4.543±2.029)明顯高于在近癌旁肝硬化組織(3.072±0.844)及遠(yuǎn)癌旁肝組織(1.559±0.695)中的相對(duì)表達(dá)量(P值均<0.01)；近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的相對(duì)表達(dá)量顯著高于遠(yuǎn)癌旁肝組織(P<0.01)。miRNA-222的表達(dá)與HCC的大小、分化程度、門靜脈瘤栓、侵襲轉(zhuǎn)移均有關(guān)聯(lián)(t值分別為7.256、9.900、2.345、4.225，P值均<0.05)；而與性別、年齡、合并病毒性肝炎及AFP升高無關(guān)(P值均>0.05)。結(jié)論 miRNA-222在HCC組織中異常高表達(dá)，檢測(cè)miRNA-222有助于HCC臨床進(jìn)展及預(yù)后的判斷。

癌， 肝細(xì)胞； 微RNAs

最新報(bào)道[1]顯示我國(guó)肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第4位，病死率在癌癥相關(guān)死亡中居第3位，但目前HCC的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)作為一類非編碼單鏈小分子RNA，通過互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因序列特異性結(jié)合，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)揮類似癌基因和抑癌基因的功能。miRNA-222屬于miRNA-221/222家族，定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，且在胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤異常表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、分期關(guān)系密切[3-5]。本研究通過檢測(cè)miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中的表達(dá)，分析miRNA-222與HCC臨床病理特征的關(guān)系，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2012年1月-2014年12月于大連市中心醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的HCC組織103例，其中男90例，女13例，年齡39～74歲，平均(57.59±8.49)歲，年齡<60歲60例，≥60歲43例；有病毒性肝炎病史者78例，無肝炎病史者25例；腫瘤大?。?5 cm者75例，≥5 cm者28例；分化程度：高中分化66例，低分化37例；出現(xiàn)門靜脈瘤栓者16例，未出現(xiàn)門靜脈瘤栓者87例；發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移39例，未見侵襲轉(zhuǎn)移64例；AFP水平升高者60例，正常者43例。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理切片確診，術(shù)前均未接受放療和化療。選擇HCC手術(shù)切除后近癌旁肝硬化組織32例、遠(yuǎn)癌旁肝組織標(biāo)本(距離腫瘤邊緣至少5 cm，且病理顯示無肝硬化形態(tài)表現(xiàn))18例，所有組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。

1.2 主要試劑 石蠟包埋組織miRNA快速提取試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan univsersal PCR Master MixⅡ、TaqMan MicroRNA分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。目的基因序列在GenBank中查找，使用Primer-Express3.0軟件設(shè)計(jì)引物，其中miRNA-222擴(kuò)增片段為155 bp，上游引物為5′-CTGGGTCTCTGATGGCATCT-3′，下游引物為5′-TGTGTGTGAGTGTGTGTGTG-3′；選擇U6基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增長(zhǎng)度為96 bp，其上游引物為5′-CTCGCTTCG-GCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)反應(yīng)

1.3.1 RNA提取 HCC、近癌旁肝硬化及遠(yuǎn)癌旁肝組織中總RNA的提取采用石蠟包埋組織miRNA快速提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，A260/A280比值在1.8～2.1，提示RNA純度較好，可用于下一步PCR操作。

1.3.2 qRT-PCR反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總反應(yīng)體系為15 μl，包括無RNA酶水4.16 μl，dNTP 0.15 μl，反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，10×RT緩沖液1.5 μl，RNA酶抑制劑0.19 μl，逆轉(zhuǎn)錄引物(miRNA-222，U6)3 μl，RNA樣本5 μl；其中總RNA為10 ng(稀釋成2 ng/μl)。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，收集cDNA產(chǎn)物常規(guī)置于-20 ℃保存。

PCR反應(yīng)：總反應(yīng)體系為20 μl，Master MixⅡ 10 μl，Small RNA Assay 1 μl，模板cDNA 1.33 μl，無RNA酶水7.67 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。miRNA表達(dá)水平用2-△△Ct表示，其中△△Ct=(CtmiRNA-222-CtU6)實(shí)驗(yàn)組-(CtmiRNA-222-CtU6)對(duì)照組，得到miRNA-222在各組中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)顯示，miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.167，P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，miRNA-222在HCC組織中的相對(duì)表達(dá)量(4.543±2.029)明顯高于其在近癌旁肝硬化組織(3.072±0.844)及遠(yuǎn)癌旁肝組織(1.559±0.695)中的相對(duì)表達(dá)量(P值均<0.01)；近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的相對(duì)表達(dá)量顯著高于遠(yuǎn)癌旁肝組織(P<0.01)(圖1)。

2.2 miRNA-222的表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 HCC腫瘤≥5 cm、低分化、有門靜脈瘤栓、發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移組中miRNA-222的相對(duì)表達(dá)量均高于相應(yīng)的腫瘤<5 cm、高中分化、無門靜脈瘤栓、未發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移組中miRNA-222的相對(duì)表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

圖1 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化及遠(yuǎn)癌旁肝組織中表達(dá)的比較 與近癌旁肝硬化組織比較， *P<0.01； 與遠(yuǎn)癌旁肝組織比較，#P<0.01

表1 不同HCC臨床病理參數(shù)之間miRNA-222的表達(dá)差異

3 討論

miRNAs可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)參與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移[6]，一些miRNAs可作為早期診斷HCC及判斷預(yù)后的指標(biāo)[7-8]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-222在HCC組織中的表達(dá)明顯高于其在近癌旁肝硬化組織及遠(yuǎn)癌旁肝組織中的表達(dá)，且近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的表達(dá)也顯著高于遠(yuǎn)癌旁肝組織，提示在肝硬化階段miRNA-222即表達(dá)增高，而在HCC組織中表達(dá)水平最高。研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA-222的表達(dá)從肝硬化至早期HCC及晚期HCC呈逐步增加態(tài)勢(shì)，提示miRNA-222高表達(dá)與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。而有研究[10]顯示miRNA-222在HCC組織中表達(dá)明顯增高，而在肝內(nèi)膽管癌組織中卻明顯降低，這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-222在不同腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性，未來可用于HCC的診斷。Zhang等[11]和Fiorino等[12]研究顯示miRNA-222在慢性HBV感染時(shí)表達(dá)增高，在HBV和HCV相關(guān)性HCC患者血清中表達(dá)水平也顯著增高，表明miRNA-222可作為診斷肝炎相關(guān)HCC可能的生物學(xué)指標(biāo)。

研究[3-4]顯示miRNA-222的表達(dá)與胃癌、結(jié)腸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可作為腫瘤的預(yù)后指標(biāo)，且miRNA-222的表達(dá)與HCC腫瘤分化程度密切有關(guān)，并與HCC患者生存期顯著相關(guān)[13]，miRNA-222高表達(dá)的HCC患者中位生存期明顯低于低表達(dá)組[9]。也有報(bào)道[10,14]顯示miRNA-222與HCC的數(shù)目、大小、分期、Child-Pugh分級(jí)及預(yù)后并無相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-222的表達(dá)水平與HCC腫瘤大小、分化程度、有無門靜脈瘤栓及發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，提示miRNA-222表達(dá)越高，HCC惡性程度就越高，越易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后越差。故檢測(cè)miRNA-222有助于HCC臨床進(jìn)展及預(yù)后的判斷。

研究[9,15]報(bào)道m(xù)iRNA-222可下調(diào)α抑制活性多肽、激活A(yù)KT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響HCC的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，在肝癌細(xì)胞系中miRNA-222可直接抑制PTEN蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致PI3K/AKT/mTOR通路激活[16]，而上調(diào)miRNA-222可抑制PTEN蛋白的表達(dá)，使HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲能力大大增強(qiáng)[17]。抑制miRNA-222的表達(dá)可增加口腔鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的化療敏感性[18]。最新研究[19]顯示miRNA-222通過調(diào)控PTEN/AKT/FOXO1信號(hào)通路參與乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥，而抑制miRNA-222能夠改善乳腺癌患者的預(yù)后。此外，miRNA-222還能夠調(diào)節(jié)HCC對(duì)索拉非尼的耐藥性[20]。因此未來通過調(diào)控HCC細(xì)胞miRNA-222的表達(dá)可能應(yīng)用于治療HCC。

綜上所述，miRNA-222在HCC組織中的表達(dá)明顯增高，且與HCC腫瘤分化程度、侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，檢測(cè)miRNA-222有助于HCC臨床進(jìn)展及預(yù)后的判斷，其可能成為HCC重要的診斷檢測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，但需要今后更深入的研究。

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引證本文：ZHANG ZQ, LU SM, WANG HL, et al. Expression of microRNA-222 in hepatocellular carcinoma tissue and its clinical significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(8): 1502-1505. (in Chinese) 張竹青， 盧書明， 王花麗， 等. microRNA-222在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(8): 1502-1505.

(本文編輯：葛 俊)

Expression of microRNA-222 in hepatocellular carcinoma tissue and its clinical significance

ZHANGZhuqing,LUShuming,WANGHuali,etal.

(DepartmentofPathology,DalianCentralHospital,Dalian,Liaoning116033,China)

Objective To investigate the expression of microRNA-222 (miRNA-222) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and its clinical significance. Methods A total of 103 HCC tissue samples were collected from the patients who underwent surgical resection in Dalian Central Hospital and The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University from January 2012 to December 2014. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miRNA-222 in HCC tissues, adjacent cirrhotic tissues, and distal liver tissues, and the association between miRNA-222 expression and the clinicopathological features of HCC was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the Dunnett′s T3 test was used for further comparison between any two groups; thet-test was used for comparison between two groups. Results There was a significant difference in the expression of miRNA-222 between HCC tissues, adjacent cirrhotic tissues, and distal liver tissues (F=27.167,P<0.001); the HCC tissues had significantly higher relative expression of miRNA-222 than the adjacent cirrhotic tissues (4.543±2.029 vs 3.072±0.844,P<0.01) and the distal liver tissues (4.543±2.029 vs 1.559±0.695,P<0.01), and the adjacent cirrhotic tissues had significantly higher relative expression of miRNA-222 than the distal liver tissues (P<0.01). The expression of miRNA-222 was significantly associated with tumor size, degree of tumor differentiation, tumor thrombus in the portal vein, and invasion/metastasis (t=7.256, 9.900, 2.345, and 4.225, allP<0.05), while it was not associated with sex, age, the presence of viral hepatitis, or increased alpha-fetoprotein level (allP>0.05). Conclusion

The expression of miRNA-222 is abnormally upregulated in HCC tissue, and miRNA-222 measurement may help to evaluate the clinical progression and prognosis of HCC.

carcinoma, hepatocellular; microRNAs

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.08.018

2017-02-28；

2017-03-30。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81502274)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015020324)；大連市衛(wèi)生局課題

張竹青(1978-)，女，主要從事消化道惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制研究。

R735.7

A

1001-5256(2017)08-1502-04