莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

亞單位疫苗在豬病防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

欄目協(xié)辦

亞單位疫苗是新型疫苗的研究熱點和開發(fā)方向。通過綜述亞單位疫苗在豬病防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為廣大科研工作者及養(yǎng)殖場戶對亞單位疫苗的研究和豬病防治提供參考。

亞單位疫苗；豬?。环乐?；研究進(jìn)展

亞單位疫苗（Subunit vaccine）是指利用致病性病原微生物的某些保護(hù)性抗原基因與適當(dāng)質(zhì)粒或病毒載體重組后導(dǎo)入受體如細(xì)菌、酵母或動物細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)，提取所表達(dá)的特定多肽，加入佐劑而制成的一種不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體和免疫保護(hù)的新型疫苗。與含有許多免疫成分的完整生物疫苗相比，亞單位疫苗只含有病原體的一部分，不含病毒核酸等感染性組分，具有無需滅活、無致病性、安全性極高等優(yōu)點。其唯一不足之處是免疫原性較低，需與佐劑合用才能產(chǎn)生較好的免疫效果。亞單位疫苗為新型疫苗的研究熱點和開發(fā)方向，是基因工程疫苗中最有前景的疫苗。我國學(xué)者在豬病亞單位疫苗研究方面進(jìn)行了大量的研究工作，提供了詳實的技術(shù)依據(jù)。本文綜述了亞單位疫苗在豬病防治中的應(yīng)用進(jìn)展，以期對亞單位疫苗的研究和豬病防治提供參考。

1 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）按血清學(xué)和基因組的差異性可分為PCV1和PCV2，其中PCV1無致病性，是一種豬腎細(xì)胞系的污染毒；而PCV2具有致病性，是引起以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為主的豬圓環(huán)病毒病的病原。有效的疫苗免疫是控制PCV2感染提高生產(chǎn)業(yè)績的關(guān)鍵。PCV2商品化疫苗問世以來，免疫效果獲得公認(rèn)，使該病得到有效控制。盡管商品化疫苗種類繁多，但主要分為rCap亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗兩種類型。采用重組桿狀病毒表達(dá)的rCap蛋白用于亞單位疫苗在國外已被注冊，國內(nèi)學(xué)者在PCV2亞單位疫苗的研究方面也做了大量工作。

1.1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

常用于PCV2亞單位疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要是昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。劉長明等[1]采用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)PCV2 Cap蛋白，該重組蛋白具有良好的免疫活性反應(yīng)。張家明[2]、李玲等[3]先后采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)PCV2 Cap蛋白并制成亞單位疫苗。葉昱等[4]構(gòu)建PCV2桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)BV-GDORF2，可同時表達(dá)PCV2衣殼蛋白和皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G），免疫小鼠可誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。郎洪武[5]成功構(gòu)建可表達(dá)PCV2 VLPs的重組桿狀病毒－家蠶表達(dá)體系，利用表達(dá)的Cap蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠和仔豬均能產(chǎn)生特異性抗體，且可有效抑制PCV2在小鼠和仔豬體內(nèi)的復(fù)制。付玉潔等[6]以PCV2a和PCV2b株分別制備了滅活疫苗和亞單位疫苗進(jìn)行鼠體免疫攻毒試驗。發(fā)現(xiàn)PCV2a-rCap蛋白亞單位疫苗組誘導(dǎo)抗體水平最高。劉丹等[7]以重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制備亞單位疫苗及以PCV2全病毒制備的滅活苗，BALB/c小鼠攻毒試驗表明rRep和Rep'蛋白不是病毒保護(hù)性抗原，Cap蛋白的抗體具有中和病毒活性。董林等[8]在構(gòu)建昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白Cap基礎(chǔ)上加入佐劑制備成PCV2b亞單位疫苗，并比較了PCV2a、PCV2b基因型全病毒滅活疫苗和PCV2b亞單位疫苗對PCV2b基因型強(qiáng)毒株免疫攻毒保護(hù)效力。結(jié)果表明三種類型PCV2疫苗免疫小鼠和仔豬后均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抵御PCV2b基因型強(qiáng)毒攻擊的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，有效抵抗PCV2感染和提高豬的生長性能。

1.2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白有兩種類型，可溶性和非可溶性（包涵體），多數(shù)研究者更傾向于可溶性蛋白的表達(dá)，但存在易被降解的缺點。為了提高可溶性蛋白的含量，一般采取兩種方法，一是通過降溫或限制營養(yǎng)物添加量降低啟動子的表達(dá)能力，從而增加了表達(dá)蛋白的可溶性，但并不完全有效。另外一種方法是使用融合標(biāo)簽，研究表明某些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其他易形成包涵體的蛋白質(zhì)融合后會促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)或者增加表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，例如多聚組氨酸標(biāo)簽、S－標(biāo)簽、谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）、SUMO標(biāo)簽已用于表達(dá)PCV2 Cap蛋白，這些融合標(biāo)簽將為進(jìn)一步的蛋白濃縮、提純、檢測等提供便利，同時也可以有效地抑制宿主蛋白酶的降解活性[9]。青島易邦“易圓凈”產(chǎn)品是國內(nèi)第一個大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的PCV2基因工程亞單位疫苗。表達(dá)的病毒樣顆粒抗原（VLPs/ CAP），抗原性好，蛋白經(jīng)過二級過柱，內(nèi)毒素含量低，臨床無副反應(yīng)產(chǎn)生。

1.3 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是基因工程研究中廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng)，與現(xiàn)有的其他表達(dá)系統(tǒng)相比，它不但克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)、大量表達(dá)易形成包涵體等缺陷，還可以彌補昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本高的缺點。曹瑞兵等[10]為了評估酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白在豬體的免疫特性以及豬α干擾素對其的免疫佐劑效果，將酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白配比適量的鋁膠或重組豬α干擾素制成亞單位疫苗。結(jié)果表明豬α干擾素可顯著增強(qiáng)Cap蛋白亞單位疫苗接種仔豬的體液免疫反應(yīng)，提高PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗免疫保護(hù)效果。酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足之處在于培養(yǎng)時間較長，容易污染。

2 豬流行性腹瀉

由于豬流行性腹瀉病毒（Porcine ep idemic diarrhea virus，PEDV）具有難以適應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)特性，因此目前市場上針對該病的疫苗均為CV777毒株生產(chǎn)的滅活苗和弱毒苗。疫苗毒株的變異，特別是S基因的變異，常導(dǎo)致現(xiàn)有常規(guī)疫苗不能提供足夠的免疫保護(hù)。PEDV的核心表位（COE）存在于S蛋白的編碼基因中，被認(rèn)為是PEDV的亞單位疫苗的重要靶標(biāo)抗原。磨健悅等[11]以殼聚糖（Chitosan，CS）包被PEDV核心抗原COE蛋白并以口服方式免疫Balb/c小鼠，發(fā)現(xiàn)CS的包被能夠提高PEDV亞單位疫苗的免疫效果，為口服PEDV亞單位疫苗提供了一種新的制備思路。黃春娟[12]成功構(gòu)建出大腸桿菌pQZ-COE-LTB原核表達(dá)載體，篩選出能明顯增強(qiáng)融合蛋白免疫原性的免疫增強(qiáng)劑CVC1303。該實驗室陳瑾等[13]針對PEDV的變異毒株，選取S蛋白的COE區(qū)域進(jìn)行亞單位疫苗的設(shè)計，并選用大腸桿菌原核表達(dá)載體進(jìn)行蛋白的可溶性表達(dá)，重組蛋白的可溶性表達(dá)方便后期蛋白的純化，為快速研制高效、實用的PEDV新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）的ORF3，ORF5和ORF7是目前研究重組亞單位疫苗的主要候選基因。由ORF5基因編碼的GP5是PRRSV最主要的免疫原性蛋白，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體?，F(xiàn)有的基于天然ORF5基因構(gòu)建的多種疫苗均難以產(chǎn)生較早和較高的中和抗體，但對ORF5基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，可以增?qiáng)GP5的免疫原性。Prieto等[14]用大腸桿菌為宿主的PRRSV GP5亞單位疫苗進(jìn)行免疫攻毒試驗，結(jié)果表明免疫組豬群臨床癥狀明顯減輕、中和抗體含量有所提高。自然感染或疫苗免疫豬均可產(chǎn)生高滴度的抗N蛋白抗體且持續(xù)時間也最長，因此由ORF7編碼的N蛋白是目前公認(rèn)最適合作PRRS診斷用的靶抗原蛋白之一。錢洪喜[15]將構(gòu)建的pPIC9k-ORF7重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞GS115中進(jìn)行蛋白表達(dá)，結(jié)果表明N蛋白能與陽性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。蘆煒[16]開展了GP5蛋白和N蛋白單克隆抗體的制備，同時以植物病毒衣殼蛋白為載體，探討了PRRS新型亞單位疫苗。也有將基因轉(zhuǎn)入植物中制備出有效的新型亞單位疫苗，Hu等[17]研制的含有PRRSV M蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米口服小鼠，試驗結(jié)果表明小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體和細(xì)胞因子。賈曉娟[18]研究認(rèn)為豬熱休克蛋白Gp96N在一定程度上能夠增強(qiáng)PRRSV亞單位疫苗的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有潛在的免疫佐劑效應(yīng)，為豬Gp96N作為免疫佐劑在疫苗中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

4 口蹄疫

口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）有7個血清型，各型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)。VP1蛋白是FMDV唯一刺激能產(chǎn)生中和抗體的最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是研究亞單位疫苗的理想抗原。Bachrach等[19]率先將VP1從FMDV中分離出來，配以不完全弗氏佐劑，制成亞單位疫苗，免疫效果良好。Kupper等[20]實現(xiàn)了VP1基因的原核表達(dá)，并通過間接ELISA和放射免疫試驗證實了其表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性。隨后研究發(fā)現(xiàn)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1和非結(jié)構(gòu)蛋白基因2A、3C串聯(lián)起來表達(dá)，可以產(chǎn)生76S的類病毒粒子，提純該病毒粒子來免疫動物，其免疫效果類似于全病毒，可以產(chǎn)生高水平的中和抗體，能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。趙凱等[21]在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白注射豚鼠和豬后產(chǎn)生保護(hù)作用。薛青紅等[22]在大腸桿菌中成功表達(dá)了FMDV的3A基因。Song等[23]將O型FMDV VP1蛋白與分子佐劑CTB—起進(jìn)行表達(dá)后接種小鼠，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體。董博翰等[24]選擇了VP1上的幾個B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，原核表達(dá)出一種重組蛋白J11-G。并證明這種重組蛋白有較好的免疫活性。目前，我國己經(jīng)有批準(zhǔn)生產(chǎn)的豬O型口蹄疫基因工程亞單位疫苗，并具有較好的免疫保護(hù)效果，但是由于其融合表達(dá)產(chǎn)物是包涵體形式的，需要經(jīng)過變性復(fù)性等工藝，實際生產(chǎn)過程較復(fù)雜。趙晨星[25]利用新型大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了兩種FMDV VP1的重組蛋白，其融合產(chǎn)物以可溶性表達(dá)，為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)。

5 豬瘟和豬水皰病

豬瘟亞單位疫苗主要是豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E2囊膜糖蛋白的亞單位疫苗。Hulst等[26]構(gòu)建了表達(dá)CSFV E2基因的重組體PAcAS3gXE2±TMR（gX是一段信號序列，TMR為病毒的跨膜區(qū)），通過桿狀病毒（Baculovirus）AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf-9。E2-TMR（無跨膜區(qū)）可分泌到培養(yǎng)基中，其最大表達(dá)量為20 mg/L。Bouma等[27]對Hulst的E2亞單位疫苗進(jìn)行了全面細(xì)致的實用性研究。結(jié)果證明豬瘟E2亞單位疫苗具有良好的保護(hù)力，可望成為用于未來控制豬瘟的最重要疫苗。田宏[28]將前期利用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)制備CSFV E2蛋白，成功構(gòu)建了帶有豬水皰病病毒P1區(qū)基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE puro-P1。表達(dá)產(chǎn)物的豚鼠免疫試驗表明，該免疫原能刺激豚鼠產(chǎn)生良好的體液及細(xì)胞免疫，具有一定的應(yīng)用前景，以填補豬水皰病疫苗的空缺。他也成功構(gòu)建了帶有CSFV E2基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE puro-E2。表達(dá)產(chǎn)物的家兔免疫攻毒試驗表明，該免疫原可刺激家兔產(chǎn)生良好的體液及細(xì)胞免疫，有望進(jìn)一步開發(fā)成良好的新型豬瘟亞單位疫苗。

6 流行性乙型腦炎

E蛋白是乙型腦炎病毒（Japanese encephalitisvirus，JEV）主要的抗原蛋白，可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，因此一般通過表達(dá)JEV的E基因來制備亞單位疫苗。Xu等[29]將JEV的E基因插入桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建得重組病毒，并利用重組桿狀病毒表達(dá)的E蛋白免疫小鼠和豬，結(jié)果表明可產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)其免受JEV的攻擊。

7 豬傳染性胸膜肺炎

胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）已發(fā)現(xiàn)有15個血清型，每個血清型毒力不同但均可引發(fā)疾病。因此，開發(fā)新型疫苗已經(jīng)成為研究熱點。APP以亞單位疫苗的應(yīng)用前景最為突出。研究表明APP分泌的外毒素（ApxI、ApxII、ApxIII）和外膜蛋白（OMP）等不僅是APP重要的毒力因子，同時也是重要的免疫原性因子，它們已經(jīng)作為4種重要的候選抗原應(yīng)用于APP亞單位疫苗的研究。盡管APP有很多毒力因子及具有免疫原性的蛋白，但單一抗原組分的亞單位疫苗只能提供部分保護(hù)，且交叉保護(hù)力弱。因此在疫苗研究中，多以Apx毒素為主要成分，多種抗原組合的亞單位疫苗為主。邵美麗[30]首次將APP菌毛（ApfA）和ApxIV作為疫苗組分進(jìn)行研究，并首次制備以4種和6種重組蛋白為組分的重組亞單位疫苗，通過對BALB/c小鼠的免疫攻毒保護(hù)試驗，與滅活疫苗進(jìn)行了保護(hù)效力的比較。首次證明了以 rApxI、rApxII、rApxIII和rOMP為組分的重組亞單位疫苗提供的交叉免疫保護(hù)效果明顯優(yōu)于以 rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfA和rOMP為組分的重組亞單位疫苗和滅活疫苗。廖永洪[31]將純化的rApxIA、rApxⅡA、rApxⅢA與對小鼠免疫保護(hù)率較高的rOmpD、rLppB組合，與新型佐劑MF59混合制備成抗原含量不同的兩種亞單位疫苗并用小鼠模型對疫苗進(jìn)行安全性和免疫效果評價。APP的單個或多個毒力因子組成的亞單位疫苗的免疫保護(hù)能力已被研究證實，但目前為止還沒有一種亞單位疫苗能夠提供完全保護(hù)。

8 豬鏈球菌病

豬鏈球菌根據(jù)菌體莢膜抗原特性的不同，可分成35個血清型（1型～34型及1/2型），其主要致病型為SS1、SS2、SS7、SS9、SS1/2以及SS14。眾多血清型中以豬鏈球菌2型Streptococcus suis serotype 2，SS2）流行最廣、致病性最強(qiáng)、造成的危害最大。SS2目前尚無用于臨床的商品化基因工程疫苗。研究表明SS2存在眾多的毒力相關(guān)因子，而有些毒力因子可作為亞單位疫苗的候選蛋白，如莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、細(xì)胞外因子、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白、Sao蛋白等。李冉[32]通過對SS2不同免疫反應(yīng)性抗原組合進(jìn)行小鼠免疫并評價不同疫苗對SS2的攻毒保護(hù)力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有良好免疫反應(yīng)性的SS2表面抗原蛋白HP0197、HP1036及Enolase組成的亞單位疫苗免疫后能顯著提高小鼠SS2人工感染存活率。

9 小結(jié)

從目前的研究成果來看亞單位疫苗的研制仍處于實驗室階段，技術(shù)仍不成熟，離預(yù)期的臨床應(yīng)用還有一段距離。加強(qiáng)下游工程的研究和加快產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程是我們今后努力的方向。只有克服新型亞單位疫苗不足之處，有效地預(yù)測和預(yù)防基因改造所帶來的潛在危害，把實驗室研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)結(jié)合起來，充分發(fā)揮亞單位疫苗的優(yōu)勢，才能為養(yǎng)豬業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展保駕護(hù)航。隨著高新技術(shù)的不斷發(fā)展和深入，疫苗生產(chǎn)中所存在的問題也將進(jìn)一步得到解決，相信不遠(yuǎn)的將來，將會有越來越多成本低、免疫力強(qiáng)、保護(hù)期長、使用方便的新型亞單位疫苗陸續(xù)誕生并必將在今后的畜禽疾病防治方面做出巨大的貢獻(xiàn)。

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2017-01-12）

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。