XPD基因在氫醌致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用

王永紅，李攀登，肖蕓，萬秀方，鄭丹，溫緣緣，趙雪，張亞莉，楊國(guó)珍

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽550004；2 德陽市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

XPD基因在氫醌致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用

王永紅1，李攀登2，肖蕓1，萬秀方1，鄭丹1，溫緣緣1，趙雪1，張亞莉1，楊國(guó)珍1

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽550004；2 德陽市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

目的 探討XPD基因在氫醌(HQ)致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用。方法 選擇5、10、20、40、80 μmol/L HQ分別對(duì)U937細(xì)胞染毒12、24、48 h，根據(jù)各濃度下U937細(xì)胞活性，選擇10、20、40 μmol/L HQ染毒24、48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取10、20、40 μmol/L HQ染毒24、48 h U937細(xì)胞，分別設(shè)為HQ低、中、高濃度組，另取未染毒U937細(xì)胞作為空白對(duì)照組，采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)各組細(xì)胞尾矩(TM)、Oliv尾矩(OTM)，采用Western blotting法檢測(cè)各組XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h TM和OTM均明顯增大(P均<0.05)；與同組染毒24 h比較，HQ低、中、高濃度組染毒48 h TM和OTM均明顯增大(P均<0.05)，染毒48 h HQ低、中、高濃度組TM和OTM依次升高(P均<0.05)。與空白對(duì)照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24 h XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，且HQ高濃度組明顯高于HQ低濃度組(P均<0.05)；染毒48 h,HQ高濃度組XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組及HQ低、中濃度組(P均<0.05)，但空白對(duì)照組及HQ低、中濃度組兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；HQ各濃度組染毒48 h XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量與染毒24 h比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 XPD基因表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HQ致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。

DNA損傷；氫醌；XPD基因；DNA修復(fù)

氫醌(HQ)是一種苯的酚類代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)領(lǐng)域。1999年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將HQ歸為第三類致癌物之一。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸HQ可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝腎損害，產(chǎn)生骨髓和血液毒性，并導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸HQ人群可出現(xiàn)骨髓造血功能障礙，甚至白血病[2]。研究認(rèn)為，HQ可通過氧化作用誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂[3]，而DNA雙鏈斷裂會(huì)啟動(dòng)核苷酸切除修復(fù)(NER)系統(tǒng)，繼而進(jìn)行切除修復(fù)。XPD 是轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH的核心組件，在DNA損傷NER過程中具有重要作用。XPD蛋白主要有兩個(gè)功能：一是穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH復(fù)合物，在NER過程中具有解旋酶功能[4]；二是參與細(xì)胞周期調(diào)控及p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。盡管XPD的解旋酶活性不是TFⅡH調(diào)控轉(zhuǎn)錄所必需的，但XPD的缺失會(huì)引起TFⅡH復(fù)合物不穩(wěn)定，繼而影響轉(zhuǎn)錄及NER過程[6]。2016年3～7月，本研究觀察了XPD基因在HQ致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U937細(xì)胞株，由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。HQ，美國(guó)Sigma公司。FBS，美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司；XPD兔單克隆抗體，美國(guó)Abcam公司；Lanin B1鼠單克隆抗體，美國(guó)Proteintech公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。穩(wěn)流電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Eclipe 80i熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Western blotting垂直電泳儀及其轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 HQ濃度篩選 取U937細(xì)胞約1×106個(gè)，置于含10% FBS完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底90%左右時(shí)，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為0.5×106個(gè)/mL，并接種于6孔板，每孔4 mL。稱取HQ 0.011 g溶于1 mL完全培養(yǎng)基制成HQ母液，再將HQ母液稀釋100倍，即為1 mmol/L HQ溶液。每孔加入適量1 mmol/L HQ溶液，使其終濃度分別為0、5、10、20、40、80 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于HQ染毒12、24、48 h收集細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液90 μL與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液10 μL混合，輕輕吹打混勻。取混合液10 μL，用改良牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)(未被臺(tái)盼藍(lán)染色液染色的細(xì)胞即為活細(xì)胞)，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。各濃度下不同時(shí)間細(xì)胞存活率比較見表1。結(jié)果表明，隨著HQ濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。根據(jù)HQ染毒24 h細(xì)胞存活率不低于50%，且HQ 0、5 μmol/L染毒24 h細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)HQ染毒濃度分別為10、20、40 μmol/L。為進(jìn)一步觀察隨著HQ染毒時(shí)間延長(zhǎng)，DNA損傷及修復(fù)基因表達(dá)情況，選擇染毒時(shí)間分別為24、48 h。

表1 HQ各濃度下染毒12、24、48 h U937細(xì)胞存活率比較

注：與 0 μmol/L HQ染毒同時(shí)間比較，*P<0.01；與5 μmol/L HQ染毒同時(shí)間比較，#P<0.01；與10 μmol/L HQ染毒同時(shí)間比較，△P<0.05；與20 μmol/L HQ染毒同時(shí)間比較，▲P<0.05；與40 μmol/L HQ染毒同時(shí)間比較，▽P<0.05；與同濃度染毒12 h比較，▼P<0.05；與同濃度染毒24 h比較，★P<0.05。

1.3 細(xì)胞染毒及DNA損傷檢測(cè) 分別收集HQ 10、20、40 μmol/L染毒24、48 h 的U937細(xì)胞(分別設(shè)為HQ低、中、高濃度組)，同期另選未染毒的U937細(xì)胞作為空白對(duì)照組。各組均加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×106個(gè)/mL。將提前預(yù)熱的1%普通瓊脂凝膠100 μL滴至磨砂載玻片上，凝結(jié)后為第一層膠。另取各組染毒24、48 h細(xì)胞懸液30 μL置于1.5 mL離心管中，加入1.5%低熔點(diǎn)瓊脂270 μL，反復(fù)吹打混勻；取混合液100 μL滴加至第一層膠上，即為第二層膠。將做好第二層膠的載玻片放入專用鋁盒中，加入細(xì)胞裂解液浸沒，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光裂解1 h，PBS沖洗，置于水平電泳槽陽極端附近，加入新鮮配制的堿性電泳液(pH=10)至完全浸沒載玻片，避光解旋20 min，25 V、300 mA電泳20 min。取出載玻片，用Tris-HCl中和液(pH=7.5)漂洗5 min×3次；取2 μg/mL EB 50 μL滴至第二層膠上，置于濕盒中，避光染色15 min，自來水沖洗3次，正置熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)取10個(gè)200倍視野，采用單細(xì)胞凝膠電泳CometScore分析軟件分析50個(gè)細(xì)胞。以尾矩(TM)和Oliv尾矩(OTM)反映細(xì)胞DNA損傷程度。

1.4 XPD蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞各2×106個(gè)，根據(jù)細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞核蛋白。細(xì)胞核蛋白經(jīng)BCA法蛋白定量后，與4×蛋白上樣緩沖液以3∶1混勻，100 ℃水浴5 min，然后行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠+10%分離膠)。取各組核蛋白25 μg上樣，80 V恒壓電泳至Marker分離(約30 min)，換用120 V恒壓電泳，當(dāng)?shù)鞍咨蠘泳彌_液到達(dá)分離膠底部時(shí)(約2 h)停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(220 mA，120 min)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入XPD兔單克隆抗體(1∶5 000)4 ℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光，顯影液顯影，定影液定影。凝膠電泳掃描儀灰度掃描后，Image J圖像分析軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以Lamin B1為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組HQ染毒不同時(shí)間DNA損傷程度比較 見表2。

2.2 各組HQ染毒不同時(shí)間XPD蛋白表達(dá)比較 見表3。

表2 各組HQ染毒不同時(shí)間DNA損傷程度比較±s)

注：與空白對(duì)照組同染毒時(shí)間比較，*P<0.05；與HQ低濃度組同染毒時(shí)間比較，#P<0.05；與HQ中濃度組同染毒時(shí)間比較，△P<0.05；與同組染毒24 h比較，▲P<0.05。

表3 各組HQ染毒不同時(shí)間XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與空白對(duì)照組染毒同時(shí)間比較，*P<0.05；與HQ低濃度組染毒同時(shí)間比較，#P<0.05；與HQ中濃度組染毒同時(shí)間比較，△P<0.05。

3 討論

苯是一種工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的有機(jī)溶劑，也是常見的環(huán)境污染物之一。因室內(nèi)裝修、汽車尾氣排放、殺蟲劑使用等原因，使眾多非職業(yè)人群長(zhǎng)期暴露于低苯環(huán)境中，而長(zhǎng)期低苯接觸可造成骨髓造血功能障礙[7]。苯對(duì)人類健康的威脅已成為公共健康領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。HQ與苯毒性密切相關(guān)，可通過氧化作用直接攻擊DNA分子或與DNA結(jié)合形成加合物，導(dǎo)致DNA鏈斷裂，繼而造成DNA損傷，最終引起染色體畸變[8]。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是目前檢測(cè)單細(xì)胞DNA損傷的常用方法，其TM和OTM可反映DNA損傷程度[9，10]，TM、OTM越大，DNA損傷越嚴(yán)重。本研究結(jié)果顯示，HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h TM和OTM均高于空白對(duì)照組；與同組染毒24 h比較，HQ低、中、高濃度組染毒48 h TM和OTM均明顯增大，且染毒48 h HQ低、中、高濃度組TM和OTM依次升高。表明HQ染毒可導(dǎo)致U937細(xì)胞DNA損傷，具有劑量-時(shí)間依賴性，與蘇晶等[11]研究結(jié)論基本一致。

研究證實(shí)，DNA損傷時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過NER、堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)及同源重組等修復(fù)機(jī)制，修復(fù)受損DNA。NER被認(rèn)為參與修復(fù)大多數(shù)DNA損傷[12]。在NER過程中，XPD基因能利用水解三磷酸核苷產(chǎn)生的能量解開受損DNA雙鏈，這是NER過程的三個(gè)限速步驟之一；同時(shí)，XPD蛋白還可與XPF形成異二聚體，對(duì)損傷的DNA鏈進(jìn)行5′-3′端切除修復(fù)[13]。XPD基因參與DNA修復(fù)、重組等多個(gè)細(xì)胞代謝過程，其在DNA修復(fù)中的作用對(duì)維持基因組穩(wěn)定尤為重要。陳麗等[14]采用cDNA微陣列技術(shù)，從慢性苯中毒患者和無苯接觸的健康人群中篩選出包括切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1等在內(nèi)的25條差異表達(dá)基因。Xiao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，XPD基因(切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因2)與慢性苯中毒有關(guān)。Chen等[16]研究認(rèn)為，XPD是與苯中毒相關(guān)的DNA修復(fù)基因之一。還有研究發(fā)現(xiàn)，XPD基因缺陷會(huì)導(dǎo)致著色性干皮病，表現(xiàn)為基因組不穩(wěn)定性增加并有易患腫瘤傾向[17]。HQ作為苯的重要代謝產(chǎn)物，研究XPD基因在HQ致細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24 h XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，且HQ高濃度組明顯高于HQ低濃度組；染毒48 h，HQ高濃度組XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組及HQ低、中濃度組。說明HQ染毒后可能啟動(dòng)了NER，通過上調(diào)XPD表達(dá)，修復(fù)受損的DNA。XPD缺失會(huì)增加基因組的不穩(wěn)定性，其高表達(dá)可能參與修復(fù)受損的DNA，雖然XPD表達(dá)上調(diào)與DNA損傷同時(shí)存在，但XPD表達(dá)上調(diào)并未隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增加，而DNA損傷卻進(jìn)一步加重。因此推測(cè)，HQ染毒后引起的DNA損傷可能沒有完全修復(fù)。DNA損傷修復(fù)途徑有多種，且基因修復(fù)需要眾多蛋白參與，一個(gè)修復(fù)基因并不能完全反映細(xì)胞DNA的整體修復(fù)情況，而且DNA損傷的修復(fù)過程時(shí)間較長(zhǎng)，而本研究觀察時(shí)間較短，也可能是DNA損傷未完全修復(fù)的原因之一。

綜上所述，XPD基因表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HQ致U937細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。但DNA損傷修復(fù)機(jī)制復(fù)雜，HQ所致DNA損傷的詳盡修復(fù)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Role of XPD gene in DNA damage repair of U937 cells induced by hydroquinone

WANGYonghong1,LIPandeng,XIAOYun,WANXiufang,ZHENGDan,WENYuanyuan,ZHAOXue,ZHANGYali,YANGGuozhen

(1SchoolofChinicalLaboratoryScience,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the role of XPD gene in DNA damage repair of U937 cells induced by hydroquinone (HQ). Methods U937 cells were treated with 5, 10, 20, 40, and 80 μmol/L HQ for 12, 24 and 48 h. According to the cell activity, we selected 10, 20, and 40 μmol/L HQ for the following experiments. U937 cells were treated with 10, 20 and 40 μmol/L HQ for 24 and 48 h, which were taken as the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups, meanwhile, the untreated U937 cells were taken as the blank control group. Single cell gel electrophoresis tail moment (TM) and Oliv tail moment (OTM) were used to detect DNA damage. The relative expression of XPD protein in each group was determined by Western blotting. Results Compared with the blank control group, TM and OTM in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 24, 48 h significantly increased (bothP<0.05). TM and OTM in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 48 h significantly increased as compared with that of the same group at 24 h (bothP<0.05), and the TM and OTM values of the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups increased successively (bothP<0.05). Compared with the blank control group, the relative expression of XPD protein in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 24 h was significantly higher (P<0.05), and the high-dose group was significantly higher than the low-dose group (P<0.05). The relative expression of XPD protein in the high-dose HQ group at 48 h was significantly higher than that in the blank control group, low-dose, and medium-dose HQ groups (P<0.05), but there was no significant difference between the blank control group and low-dose and medium-dose HQ groups (allP>0.05). The relative expression of XPD protein in each group at 48 h was not significantly different from that at 24 h (allP>0.05). Conclusion The up-regulation of XPD gene expression promotes the repair of DNA damage of U937 cells induced by HQ.

DNA damage; hydroquinone; XPD gene; DNA repair

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360437)；貴州省科教青年英才培養(yǎng)工程項(xiàng)目(黔省專合字〔2012〕164號(hào))。

王永紅(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樵煅獡p傷的分子機(jī)制。E-mail: 1239976713@qq.com

張亞莉(1973-)，女，教授，主要研究方向?yàn)樵煅獡p傷的分子機(jī)制。E-mail： zhangyl20011002@aliyun.com 楊國(guó)珍(1954-)，女，教授，主要研究方向?yàn)槌錾毕莺Y查及其發(fā)病機(jī)制。E-mail： yangguozhen-kong@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.002

Q754

A

1002- 266X(2017)28- 0005- 04

2016-12- 07)