楊 碩，江 豐，劉 艷，李詩瑤，王鳴秋，馬 弋，林 敏，張 莉*

多重微滴式數(shù)字PCR定量檢測市售核桃乳中核桃、大豆源性成分

楊 碩，江 豐，劉 艷，李詩瑤，王鳴秋，馬 弋，林 敏，張 莉*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430000）

目的：為市售核桃乳中核桃源及主要摻雜物種大豆兩種源性成分建立準(zhǔn)確、快速定量檢測方法。方法：從植物組織（核桃、大豆）或是植物蛋白飲料（核桃乳飲料）提取核酸后，主要采用多重微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，測算單位質(zhì)量核桃和大豆的目的基因拷貝數(shù)比值，建立基因拷貝數(shù)與質(zhì)量之間的關(guān)系，進(jìn)而利用該比例關(guān)系換算出植物蛋白飲料中核桃和大豆的投料量，以實(shí)現(xiàn)對植物蛋白飲料中植物源性成分的定量檢測。結(jié)果：基于多重微滴式數(shù)字PCR定量檢測市售產(chǎn)品中大豆和核桃源性組分的方法，引物探針特異性好，目標(biāo)物種間無交叉反應(yīng)；靈敏度高，核桃中摻雜大豆的質(zhì)量檢測限為0.5%，相對誤差為5.6%。將單一源性5 種不同質(zhì)量下靶基因拷貝數(shù)之比與5 種不同比例混合源性靶基因拷貝數(shù)之比通過重復(fù)3 次檢測，綜合比較并擬合后得到單位質(zhì)量下拷貝數(shù)（C大豆/C核桃=1.771 1）的換算比例值。在從商品超市中抽取的11 份不同品牌的核桃乳中（僅含核桃一種植物源成分），多重微滴式數(shù)字PCR方法檢測顯示：11 份樣品均檢出核桃源性成分，6 份樣品檢出大豆源性成分，其中4 份樣品中大豆與核桃質(zhì)量之比高于10%，判斷存在摻雜使假；2 份樣品大豆與核桃質(zhì)量之比低于0.2%，極低的檢出量推斷為工藝沾染。結(jié)論：采用多重微滴式數(shù)字PCR準(zhǔn)確、快速的定量方法可作為鑒別核桃乳中摻雜使假問題的有效手段。

核桃乳；多重微滴式數(shù)字PCR；投料比；摻雜使假

植物蛋白飲料天生具備的“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”品類特征，符合飲料市場發(fā)展潮流和趨勢，越來越受消費(fèi)者喜愛，已經(jīng)成為飲料市場上不可或缺的產(chǎn)品。2015年銷量和銷售額的年增長率分別達(dá)到21.6%和28%。預(yù)計(jì)到2019年，我國植物蛋白飲料市場規(guī)模將達(dá)到1 594億 元左右。但隨著市場需求激增和原料價(jià)格的上漲，部分生產(chǎn)企業(yè)為了減少生產(chǎn)成本，在植物蛋白飲料中摻入廉價(jià)的植物蛋白粉，或者摻入成本低廉的非產(chǎn)品標(biāo)識的植物原料，以次充好、摻雜使假等問題日益突出，而食品安全監(jiān)管檢測機(jī)構(gòu)缺乏對該類產(chǎn)品中摻雜物種的定量檢測方法，使得植物蛋白飲料摻雜使假問題一直是行業(yè)監(jiān)管難題[1]。目前關(guān)于食品中摻雜使假鑒定方法，國內(nèi)文獻(xiàn)記載較多的是蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、色譜和質(zhì)譜技術(shù)，以及基礎(chǔ)分子生物學(xué)檢測技術(shù)，但這些技術(shù)存在前處理復(fù)雜、自動(dòng)化程度差、通量低、涉及多種生物學(xué)毒性試劑等缺陷，難以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的食品質(zhì)量安全監(jiān)測[2]。數(shù)字微滴式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的核酸檢測及定量方法，它不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，可直接測得樣品中目標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)，被稱為“第3代PCR”技術(shù)[3-5]。目前已應(yīng)用于微生物豐度檢測[6]、病毒載量的絕對定量[7]、罕見基因突變檢測[8]，食品中源性成分鑒定[9]等方面，并且多項(xiàng)研究表明數(shù)字PCR方法比實(shí)時(shí)熒光PCR定量方法更方便、定量結(jié)果更準(zhǔn)確、更靈敏[10-14]。鑒于此，該技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力越來越受到關(guān)注，目前已有3 項(xiàng)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃項(xiàng)目獲得立項(xiàng)并開展研究[15-17]。同時(shí)，基于多重微滴式數(shù)字PCR法的檢測在轉(zhuǎn)基因成分和動(dòng)物源性成分定量中也有較成熟應(yīng)用[18-19]，但將多重微滴式數(shù)字PCR應(yīng)用于植物蛋白飲料中植物源性成分檢測，并利用本研究測定出的單位質(zhì)量下靶基因拷貝數(shù)之比換算源性成分含量之比的定量檢測研究內(nèi)容尚屬空白[20]。本研究以核桃乳為例，采用多重微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，建立精準(zhǔn)、快速的定量檢測核桃乳產(chǎn)品中主要摻雜物種大豆[3]的實(shí)驗(yàn)方法，可作為現(xiàn)有方法技術(shù)之補(bǔ)充，為飲料行業(yè)食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃乳飲品由湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院在武漢市三家主流商超抽取的各品牌核桃乳（不含復(fù)合核桃乳飲料）共計(jì)11 批次。同時(shí)購買核桃、大豆、花生、芝麻、榛子、杏仁作為實(shí)驗(yàn)對照。

植物核酸提取試劑盒 美國Thermo Fisher公司；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)用試劑、反應(yīng)預(yù)混液、微滴發(fā)生油及相應(yīng)耗材 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠 美國Sigma公司；PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)用試劑、反應(yīng)預(yù)混液、DNA Marker 天根生化科技（北京）有限公司；引物、探針 生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mag max96全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng) 美國Thermo Fisher公司；微滴式數(shù)字核酸檢測分析系統(tǒng)、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；核酸蛋白濃度測定儀 德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

充分搖勻待檢樣品，吸取30～40 mL至離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，留取100 mg沉淀待用。核桃乳產(chǎn)品基質(zhì)性狀較單一，通過離心沉淀組織耗時(shí)短，與下游的磁珠法提取核酸方法結(jié)合可在2 h內(nèi)處理數(shù)10 份樣品，且沒有交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

將對照樣品各取少量，充分碾碎，取100 mg組織放入離心管中，待用。

1.3.2 核酸提取

采用專用植物核酸提取試劑盒[21]，全自動(dòng)核酸提取設(shè)備提取基因組DNA，具體操作步驟參照相關(guān)試劑盒及設(shè)備使用說明書，根據(jù)實(shí)際情況略有調(diào)整。

1.3.3 DNA質(zhì)量濃度測定

吸取DNA模板2.5 μL，放入核酸蛋白濃度測定儀中，測算質(zhì)量濃度，質(zhì)量濃度均在10～40 ng/μL，A260nm/A280nm在1.6～2.2之間，適宜后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 定性PCR（通用ITS2基因擴(kuò)增）驗(yàn)證模板質(zhì)量

ITS是植物系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一，大量國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)表明使用ITS2序列作為植物物種鑒定已十分成熟[22-24]。本實(shí)驗(yàn)采用ITS2通用引物參照文獻(xiàn)[24]，引物序列見表1，反應(yīng)體系：PCR Mix（2×）12.5 μL，上游和下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），模板DNA，加無菌雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件見表2。

表1 PCR引物及探針序列Table 1 Sequences of PCR primers and probes used in this study

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

取6 μL PCR產(chǎn)物，在已加入Gelview的1.5%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液中電泳40 min（100 V）。以600 bp ladder DNA Marker作為分子質(zhì)量對照，于凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.3.5 特異性及檢測限檢測

分別提取大豆、花生、核桃、杏仁、榛子、芝麻6 種植物源基因組，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增大豆、核桃特異性靶標(biāo)，靶標(biāo)信息引用SN/T 1961.19—2013《出口食品過敏原成分檢測 第19部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測大豆成分》[25]、SN/T 1961.2—2007《食品中過敏原成分檢測方法 第2部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測花生成分》[26]、SN/T 1961.6—2013《出口食品過敏原成分檢測 第6部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測胡桃成分》[27]、SN/T 1961.9—2013《出口食品過敏原成分檢測 第9部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測杏仁成分》[28]、SN/T 1961.8—2013《出口食品過敏原成分檢測 第8部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測榛果成分》[29]、SN/T 1961.12—2013《出口食品過敏原成分檢測 第12部分 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測芝麻成分》[30]相關(guān)內(nèi)容。

靈敏度檢測兩物種混合物中摻雜物種大豆源的檢出水平。將大豆與核桃按質(zhì)量0.1%～60%混合，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，測定該法的檢測限。

1.3.6 單一源性和混合源性兩物種單位質(zhì)量基因拷貝數(shù)關(guān)系測算

分別稱取大豆和核桃各5、10、20、40、60 mg，提取DNA后測得質(zhì)量濃度上機(jī)檢測拷貝數(shù)；將大豆按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、10%、30%、60%混合在核桃中，提取DNA后測得質(zhì)量濃度上機(jī)檢測拷貝數(shù)。將兩組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3 次，得出的大豆和核桃單位質(zhì)量基因拷貝數(shù)之比（C大豆/C核桃），行F檢驗(yàn)，比較兩組拷貝數(shù)之比的差異性。

1.3.7 多重微滴式數(shù)字PCR檢測并計(jì)算市售核桃乳中大豆源與核桃源成分投料比

采用多重微滴式數(shù)字PCR檢測，適當(dāng)調(diào)整擴(kuò)增靶標(biāo)的反應(yīng)條件，由于所使用的數(shù)字PCR為雙檢測通道，在探針設(shè)計(jì)上，將核桃和大豆的報(bào)告基因分別采用FAM和HEX，猝滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記。引物、探針序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃乳產(chǎn)品的DNA提取效果及質(zhì)量

表3 DNA質(zhì)量濃度測定及質(zhì)控Table 3 DNA concentration and availability evaluation

圖1 11 份樣品及陽性、陰性對照ITS2基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis images of ITS2 gene fragments amplified by PCR from 11 samples and positive and negative controls

核桃乳（露）中的DNA經(jīng)過高溫、高壓、滅菌等多道加工工藝，核酸濃度和質(zhì)量會(huì)受其影響，為保證下游實(shí)驗(yàn)有效性，對DNA模板進(jìn)行質(zhì)控十分必要。本實(shí)驗(yàn)采用植物通用引物擴(kuò)增ITS2基因，判斷模板質(zhì)量可否滿足實(shí)驗(yàn)條件。擴(kuò)增前核酸濃度測定結(jié)果見表3，擴(kuò)增結(jié)果顯示：除陰性及空白對照外，所有樣品均能擴(kuò)增出380 bp的條帶，如圖1所示，提取的模板質(zhì)量可適用后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 引物探針特異性實(shí)驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光PCR對大豆和核桃靶基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，核桃的引物探針特異性良好，核桃的引物探針只擴(kuò)增出核桃源，且其他5 種源性均沒有擴(kuò)增，如圖2所示。大豆的引物探針只對大豆有擴(kuò)增，其余5 種源性均沒有擴(kuò)增，如圖3所示。以上結(jié)果說明兩組引物探針的特異性良好，可以用于后續(xù)的微滴式數(shù)字PCR定量檢測實(shí)驗(yàn)。

圖2 大豆引物、探針特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測Fig. 2 Specificity of soybean-specific primer and probe set used in real-time PCR

圖3 核桃引物、探針特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測Fig. 3 Specificity of d walnut-specific primer and probe set used in real-time PCR

2.3 大豆和核桃單一源性質(zhì)量與拷貝數(shù)的關(guān)系

表4 單一源性不同質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系Table 4 Relationship between the mass of pure samples of each species and gene copy number

為考察大豆、核桃的單位質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系，分別提取5 個(gè)不同質(zhì)量梯度（5～60 mg）的大豆和核桃DNA。將提取的DNA進(jìn)行微滴數(shù)字PCR檢測基因拷貝數(shù)，以水為空白對照。由表4可以看出，大豆和核桃質(zhì)量與拷貝數(shù)之間均呈明顯線性關(guān)系。且根據(jù)5 個(gè)質(zhì)量梯度計(jì)算出C大豆/C核桃平均值為1.758 3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.66%，C大豆/C核桃的穩(wěn)定性較高（表4）。線性擬合后C大豆/C核桃為156/88.08=1.771 1（圖4）。

圖4 線性擬合后單位質(zhì)量大豆和核桃基因拷貝數(shù)之比Fig. 4 Linear curves of gene copy number against mass of soybean and walnut

2.4 兩物種混合源性單位質(zhì)量基因拷貝數(shù)關(guān)系及差異性比較

數(shù)字PCR分別檢測大豆含量為0.5%、1%、10%、30%和50%的5 個(gè)樣品中大豆和核桃基因拷貝數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證C大豆/C核桃的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。表5顯示，5 個(gè)不同大豆含量混合樣品的C大豆/C核桃平均值為1.787 7，相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.86%（表5）。將單一源性（表4）和混合源性（表5）的單位質(zhì)量大豆與核桃基因拷貝數(shù)之比的兩組數(shù)據(jù)行t檢驗(yàn)雙樣本等方差假設(shè)（F檢驗(yàn)顯示方差齊），P值為0.405 0，說明C大豆/C核桃在單一源性和混合源性檢測中沒有顯著差異。因此，在本實(shí)驗(yàn)后期待測樣品檢測中應(yīng)用線性擬合后的C大豆/C核桃為1.771 1，用于換算源性成分投料比。

表5 混合源性樣品中質(zhì)量比與拷貝數(shù)關(guān)系Table 5 Relationship between the proportion of soybean added to walnut and gene copy number

表6 微滴檢測結(jié)果Table 6 DNA copies detected by ddPCR

2.5 定量檢測樣品中核桃、大豆含量的多重微滴式數(shù)字PCR結(jié)果

分別對市售11 份純核桃乳及大豆、核桃單一源、混合源質(zhì)控樣本采用數(shù)字PCR檢測靶基因拷貝數(shù)，質(zhì)控多重微滴式數(shù)字PCR結(jié)果見圖5。樣品檢測結(jié)果顯示：在抽檢的11 份核桃乳中，均檢出核桃成分，與產(chǎn)品標(biāo)簽信息吻合（圖6），但有4 份檢出一定比例的大豆成分（圖7），而產(chǎn)品標(biāo)簽上未標(biāo)示有大豆，說明該4 份產(chǎn)品實(shí)為核桃、大豆混合產(chǎn)品，進(jìn)一步表明核桃乳產(chǎn)品中存在摻雜使假情況。兩種源性基因濃度及利用上述拷貝數(shù)關(guān)系（C大豆/C核桃）為1.771 1比值換算投料比結(jié)果詳見表6。

圖5 多重?cái)?shù)字PCR檢測引物特異性Fig. 5 Specificity of primer and probe set used in 2D-ddPCR

圖6 1#～11#樣品檢出核桃陽性微滴一維圖Fig. 6 ddPCR detection of walnut-derived ingredients in 11 samples

圖7 1#～11#樣品檢出大豆陽性微滴一維圖Fig. 7 ddPCR detection of soybean-derived ingredients in 11 samples

3 討 論

作為絕對定量檢測方法，多重微滴式數(shù)字PCR技術(shù)已經(jīng)為食品安全定量檢測帶來全新的解決方案，其在食品安全檢測領(lǐng)域產(chǎn)生的影響逐漸開始顯現(xiàn)[5]。鑒于多重微滴式數(shù)字PCR方法是在同一個(gè)PCR反應(yīng)中完成多個(gè)靶標(biāo)基因拷貝數(shù)的檢測，因此，靶標(biāo)基因拷貝數(shù)比值既不受模板DNA量和PCR反應(yīng)抑制物等的影響，也不受樣品DNA降解和PCR擴(kuò)增效率等的影響[20,31]，在成分定量檢測準(zhǔn)確性方面比單重?cái)?shù)字PCR方法更高[18]。在本研究中，通過采用多重微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測5 個(gè)不同大豆含量與固定核桃含量混合樣品中的拷貝數(shù)比值發(fā)現(xiàn)：單位質(zhì)量下C大豆/C核桃平均值為1.787 7，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.86%，從而建立了核桃中摻雜大豆的精準(zhǔn)定量檢測方法。

將多重微滴式數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用于植物蛋白飲料中植物源性成分分析檢測對比現(xiàn)有方法有以下優(yōu)點(diǎn)：第1，與特征性蛋白（蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、色譜和質(zhì)譜技術(shù)全部是基于特異性蛋白）檢測相比較，更基本、更穩(wěn)定、更靈敏的基因水平的檢測更適用于深加工、低豐度的飲料類終端產(chǎn)品[32-34]；第2，基于先進(jìn)的數(shù)字PCR技術(shù)高靈敏度和特異性，尤其在本研究中，多重微滴式數(shù)字PCR測定核桃、大豆的靶基因濃度，使用的是同一個(gè)DNA樣品、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，因而誤差更小，定量結(jié)果更加接近真值；第3，在區(qū)分食品中非標(biāo)示物種源性的檢出是有意摻假還是無意沾染的問題上，定量PCR無法提供有效的解決辦法，而數(shù)字PCR則可以通過對源性成分的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量，并依據(jù)拷貝數(shù)含量與質(zhì)量的相關(guān)性，估算源性成分的質(zhì)量比，從而可以將有意摻假和無意沾染區(qū)分開來[20,35]。在本研究中，同時(shí)檢測兩種植物源性各自的靶基因拷貝數(shù)，再綜合基因拷貝數(shù)與質(zhì)量之間的換算關(guān)系，即可直觀判斷一份產(chǎn)品中兩者的質(zhì)量比例關(guān)系。

另外，相比較與其他食品的基質(zhì)特點(diǎn)，植物蛋白飲料類產(chǎn)品的核酸提取難度更甚。原因一是在生產(chǎn)加工過程中，各種工業(yè)化處理對植物原料的遺傳物質(zhì)破壞影響較大，二是產(chǎn)品本身含水量高，實(shí)質(zhì)內(nèi)含物占比低，這進(jìn)一步稀釋了核酸濃度，加大了提取的難度[36]。然而優(yōu)質(zhì)的DNA模板質(zhì)量是保證下游實(shí)驗(yàn)有效性的關(guān)鍵，所以在本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，專門比較摸索3 種主流的DNA提取方法，比較結(jié)果表明，針對植物蛋白飲料核酸提取達(dá)到最優(yōu)效果的是專用植物核酸提取試劑與磁珠法提取核酸結(jié)合運(yùn)用。飲料原液經(jīng)高速離心得到的沉淀與專用裂解液充分混合，裂解液裂解細(xì)胞壁及細(xì)胞膜使核酸暴露到細(xì)胞外。加入磁珠并充分混合使核酸與磁珠結(jié)合，適時(shí)添加磁場，從而使核酸與體系中的其他成分分離。利用清洗液清洗，去除體系中的鹽、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。最后利用洗脫液將結(jié)合到磁珠上的核酸重新溶解。該法具有簡便、高效的特點(diǎn)，可在液體工作站上實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)控制。特別適合食品安全監(jiān)管中大批量檢測的對高通量技術(shù)的要求。

表6和圖7顯示，在兩份樣品中各檢出1 個(gè)大豆陽性微滴信號，低于該方法檢測限，考慮為儀器噪聲或?qū)嶒?yàn)操作原因，也可能是產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的無意沾染，而帶入的極低含量大豆。由于數(shù)字PCR的極高靈敏度，在本研究中有6 份樣品顯示檢出大豆陽性微滴，而相比較與其中4 份樣品中大豆核桃質(zhì)量比值均在10%以上的情況，2 份樣品的大豆核桃質(zhì)量比低于0.2%，極顯著低于前者，考慮到目前摻假行為多是經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型摻假，摻雜含量較高，因此，當(dāng)極低的核酸拷貝數(shù)檢出時(shí)考慮為生產(chǎn)環(huán)節(jié)無意沾染而非惡意摻雜使假。

綜上，本研究可作為核桃乳中摻入大豆源性定量檢測的有效方法，也可為其他與食品鑒偽相關(guān)的方法研究提供參考依據(jù)。

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Duplex Digital Droplet PCR for the Determination of Walnut-Derived and Soybean-Derived Ingredients in Walnut Protein Drink

YANG Shuo, JIANG Feng, LIU Yan, LI Shiyao, WANG Mingqiu, MA Yi, LIN Min, ZHANG Li*
(Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test, Wuhan 430000, China)

Objective: The aim of this study was to establish a new method for the rapid and accurate quantification of walnut-derived ingredients and adulterated ingredients, mainly derived from soybean, in commercial walnut beverage using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR). Methods: This method was based on the ratio between the numbers of target gene copies per unit mass of walnut and soybean, which could represent the relationship between gene copy number and the mass of plant materials. The soybean lectin gene and the walnut Jugr2 gene were chosen as the target genes according to the commercial inspection standard SN/T 1961-2013. The specificity of the assay was evaluated by testing DNA from six different species using the species-specific primers and probes. The results showed that there was no crossreaction among the target species and high sensitivity was observed. The ddPCR assay showed a limit of detection (LOD) for added soybean-derived ingredients in walnut protein drink was 0.5% with a relative error of 5.6%. The ratios of target gene copy numbers between soybean and walnut in pure samples of five different masses and between the two species in five mixtures with different proportions were determined three times, and the experimental data were fitted to a linear equation to calculate the ratio between gene copy numbers per unit mass soybean and walnut (Csoybean/Cwalnutratio = 1.771 1). Furthermore, we applied this method to test 11 commercial brands of walnut beverage, and it turned out that walnut-derived ingredients were detected in all these samples and 6 of them were found to also contain soybean-derived ingredients, out of which 4 were adulterated with more than 10% soybean and the others contained as low as 0.2% soybean, which may be unintentionally incorporated during the production process. Conclusion: The ddPCR assay can provide a rapid and accurate quantitative method for the identification of adulterated walnut beverage.

10.7506/spkx1002-6630-201716045

R155

A

1002-6630（2017）16-0280-07

2017-01-17

湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院自主立項(xiàng)科研項(xiàng)目（ZZLX2016009）

楊碩（1985—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測。E-mail：shuoshuo2015@foxmail.com

*通信作者：張莉（1978—），女，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測與管理。E-mail：siyi-541@163.com

楊碩, 江豐, 劉艷, 等. 多重微滴式數(shù)字PCR定量檢測市售核桃乳中核桃、大豆源性成分[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 280-286. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716045. http://www.spkx.net.cn

YANG Shuo, JIANG Feng, LIU Yan, et al. Duplex digital droplet PCR for the determination of walnut-derived and soybeanderived ingredients in walnut protein drink[J]. Food Science, 2017, 38(16): 280-286. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716045. http://www.spkx.net.cn

Key words: walnut protein drink; duplex digital droplet polymerase chain reaction (PCR); mass ratio; adulteration