周 巍，李月華，孫 勇，李永波，張 濤，劉 瓊，張 巖,*，王麗霞,*

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)定量檢測(cè)發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌

周 巍1，李月華1，孫 勇2，李永波1，張 濤1，劉 瓊1，張 巖1,*，王麗霞1,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071；2.北京食品科學(xué)研究院，中國(guó)肉類(lèi)食品綜合研究中心，北京 100068）

基于微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)，建立發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法。以金黃色葡萄球菌nuc基因?yàn)槟康钠卧O(shè)計(jì)特異性的引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，通過(guò)活菌提取和ddPCR方法對(duì)靶標(biāo)基因的檢測(cè)特異性和靈敏度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析。本研究建立了發(fā)酵乳中ddPCR技術(shù)定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，檢測(cè)特異性良好，檢測(cè)靈敏度為3.3×101CFU/g，定量的偏差率為+10.18%，證明了ddPCR用于絕對(duì)定量檢測(cè)的可行性，為其他食品污染菌和致病菌標(biāo)準(zhǔn)化控制體系提供有益的示范作用。

微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)；發(fā)酵乳；定量檢測(cè)；金黃色葡萄球菌

發(fā)酵乳中污染菌和致病菌的質(zhì)量控制需要精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)體系作為支撐，發(fā)酵乳因其營(yíng)養(yǎng)豐富的特性能夠滿(mǎn)足污染菌和致病菌的生長(zhǎng)需求，單一的對(duì)終產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)容易造成原輔料等生產(chǎn)資源的浪費(fèi)，因而增加了生產(chǎn)成本[1-5]。因此，不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的污染菌和致病菌數(shù)量的精準(zhǔn)檢測(cè)是進(jìn)行過(guò)程質(zhì)控的關(guān)鍵[6-8]。

由林彩琴等[9]提出的數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）作為第3代PCR的技術(shù)代表[10]，是把一個(gè)樣本的反應(yīng)體系均勻分配到大量反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中不包含或包含一個(gè)到多個(gè)目的核酸序列，獨(dú)立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布以及熒光信號(hào)陽(yáng)性的反應(yīng)單元數(shù)量占所有反應(yīng)單元的比例來(lái)計(jì)算目的核酸序列的拷貝數(shù)，dPCR中熒光信號(hào)的產(chǎn)生過(guò)程基本與實(shí)時(shí)定量PCR相同[11]。微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）技術(shù)是利用油包水原理完成微滴信號(hào)檢測(cè)，具有應(yīng)用范圍廣、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[12-15]，目前，該技術(shù)已經(jīng)在稀有突變檢測(cè)、動(dòng)植物源性成分檢測(cè)、病原菌檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異分析和復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)等方面廣泛應(yīng)用[16-25]。

本實(shí)驗(yàn)旨在將ddPCR技術(shù)應(yīng)用到發(fā)酵乳中常見(jiàn)污染菌和致病菌的檢測(cè)體系構(gòu)建中，利用死細(xì)菌去除方法，結(jié)合ddPCR技術(shù)的精準(zhǔn)定量，開(kāi)發(fā)出發(fā)酵乳中污染菌和致病菌的檢測(cè)方法，為發(fā)酵乳生產(chǎn)企業(yè)的過(guò)程控制提供必要的技術(shù)保障，也為ddPCR技術(shù)在其他污染菌和致病菌檢測(cè)中推廣應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳 市購(gòu)；實(shí)驗(yàn)采用菌株詳見(jiàn)表1。所有菌株采購(gòu)到貨后首先用各自的指示培養(yǎng)基進(jìn)行活化，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接傳代3 次后備用。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains tested in this study

2×探針?lè)〝?shù)字PCR預(yù)混液、微滴發(fā)生專(zhuān)用油、微滴分析專(zhuān)用油 德國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)菌處理液（Reagent D）、磁珠法提取細(xì)菌DNA試劑盒 美國(guó)Biotecon Diagnostics公司；引物（正向引物，反向引物）、探針由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200 Droplet Reader、DG8 cartridge微滴生成卡、Holder微滴發(fā)生器、PCR基因擴(kuò)增儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)、711全自動(dòng)DNA提取儀 美國(guó)Thermo公司；1-14臺(tái)式高速離心機(jī)美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 活菌基因組的提取

1.3.1.1 Reagent D處理細(xì)菌培養(yǎng)液

將傳代3 次后的細(xì)菌培養(yǎng)液充分搖勻，吸取100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液加入到2 mL的滅菌透明離心管中；將Reagent D從-20 ℃取出，室溫25 ℃放置融化，取400 μL的Reagent D溶液加入到上述離心管中，室溫條件下避光培養(yǎng)5 min；將離心管置于低溫離心管架中，放在500 W鹵素?zé)粝嗑?5～20 cm的正下方，曝光培養(yǎng)5 min后，8 000 r/min離心5 min；用移液器小心去除上清液，向離心管中加入100 μL無(wú)菌去離子水充分混勻，此菌懸液即可直接用于基因組的提取。

1.3.1.2 Food Proof磁珠提取法

1）取1 mL Reagent D處理后細(xì)菌培養(yǎng)液加入至2 mL試管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，添加700 μL的裂解緩沖液以及80 μL的蛋白酶K，65 ℃振蕩水浴30 min，12 000×g離心5 min，準(zhǔn)備好上清液用于DNA提取。

2）準(zhǔn)備儀器需要的加樣板、反應(yīng)結(jié)合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板，并根據(jù)需要使用微量移液器或排式微量移液器將每種板對(duì)應(yīng)的緩沖液添加至需要使用的樣品孔。

3）其中反應(yīng)結(jié)合板每個(gè)樣品孔需添加250 μL的反應(yīng)結(jié)合緩沖液和20 μL的磁珠顆粒且2 種液體需吹打混勻；洗滌板Ⅰ每個(gè)樣品孔需添加600 μL的洗滌緩沖液Ⅰ；洗滌板Ⅱ每個(gè)樣品孔需添加800 μL的洗滌緩沖液Ⅱ；洗脫板每個(gè)樣品孔需添加80 μL的洗脫緩沖液。

4）分別移取第1步前處理離心完畢500 μL裂解液轉(zhuǎn)移至已添加有反應(yīng)結(jié)合緩沖液和磁珠顆粒的反應(yīng)結(jié)合板相應(yīng)樣品孔。

5）打開(kāi)儀器電源開(kāi)關(guān)，選擇所需的應(yīng)用程序（細(xì)菌提取選擇MPKⅣ程序）。

6）重復(fù)按Start按鈕，根據(jù)屏幕指示分別將加樣板、反應(yīng)結(jié)合板B、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板放置到指定位置。

7）當(dāng)所有平板裝載完畢后，點(diǎn)擊Start按鈕儀器開(kāi)始運(yùn)行核酸自動(dòng)提取程序，大約需要35～40 min。

8）程序運(yùn)行完畢后，根據(jù)儀器屏幕指示開(kāi)始逐步卸載已經(jīng)完成核酸提取任務(wù)的加樣板、反應(yīng)結(jié)合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ、洗脫板，注意此時(shí)DNA已經(jīng)溶解于洗脫板可用于后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)，及時(shí)將已經(jīng)完成核酸提取任務(wù)的反應(yīng)結(jié)合板、洗滌板Ⅰ、洗滌板Ⅱ、洗滌板Ⅲ相應(yīng)樣品孔的廢液使用微量移液器移除。

9）使用微量移液器將洗脫板上提取的DNA分別轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中定容至80 μL，可直接用于PCR實(shí)驗(yàn)或4～8 ℃保存幾天，或-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

金黃色葡萄球菌特異性檢測(cè)基因較少，選擇文獻(xiàn)報(bào)道較多的nuc基因?yàn)榘袠?biāo)基因[26-30]，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知序列中選取特異性強(qiáng)且相對(duì)保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物探針，并通過(guò)Oligo 7.37進(jìn)行驗(yàn)證，再進(jìn)行BLAST在線比對(duì)后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定上述菌株的引物探針，如表2所示。

表2 引物探針序列Table 2 Primer and probe sequences used in this study

1.3.3 單一污染菌和致病菌ddPCR檢測(cè)方法的建立

ddPCR檢測(cè)方法：步驟1：配制ddPCR體系，體系為2×探針?lè)〝?shù)字PCR預(yù)混液10 μL，將引物稀釋到10 μmol/L，取1.2 μL上下游引物和0.4 μL探針加入體系，加入4.4 μL的模板，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。步驟2：將充分混勻的PCR體系轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，并向微滴發(fā)生卡中加入70 μL微滴發(fā)生專(zhuān)用油，將微滴發(fā)生卡放到微滴發(fā)生器中進(jìn)行反應(yīng)。隨后將生成的微滴轉(zhuǎn)移到ddPCR的96 孔中，用封膜儀對(duì)96 孔板封膜，準(zhǔn)備進(jìn)行PCR。步驟3：ddPCR的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火45 s；進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，98 ℃延伸10 min。步驟4：ddPCR結(jié)束后將96 孔板放入QX200 Droplet Reader儀器中，依次錄入樣品信息，檢測(cè)開(kāi)始后儀器按順序自動(dòng)識(shí)別每個(gè)樣品的微滴，在微滴讀取油的配合下微滴依次通過(guò)雙色檢測(cè)器，根據(jù)微滴發(fā)出的熒光信號(hào)的強(qiáng)度判定陽(yáng)性和陰性結(jié)果，并記錄每個(gè)樣品的陽(yáng)性和陰性的微滴數(shù)。信號(hào)采集完畢后，采用Quantasoft軟件計(jì)算出最終結(jié)果并以圖像的形式給出。

1.3.4 ddPCR檢測(cè)方法的溫度優(yōu)化

在設(shè)計(jì)ddPCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序時(shí)，對(duì)ddPCR的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)金黃色葡萄球菌設(shè)置退火約為52～63 ℃的溫度梯度ddPCR。根據(jù)微滴檢測(cè)儀生成的結(jié)果篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.3.5 ddPCR檢測(cè)特異性驗(yàn)證

分別提取表1中所列菌株的純培養(yǎng)物過(guò)夜菌液的DNA，將提取的DNA分別稀釋到濃度為103拷貝數(shù)，按照分別優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行金黃色葡萄球菌的特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 ddPCR檢測(cè)靈敏度

發(fā)酵乳分別按照國(guó)標(biāo)法檢測(cè)證實(shí)沒(méi)有被金黃色葡萄球菌污染。將其人工添加到發(fā)酵乳中，保證樣品中金黃色葡萄球菌的濃度依次為100～106CFU/g，隨后按照1.3.1節(jié)方法完成污染物中細(xì)菌的基因組DNA的提取工作，并用ddPCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌污染酸奶的靈敏度。

1.3.7 ddPCR絕對(duì)定量

從NCBI上查找出金黃色葡萄球菌nuc相應(yīng)的靶基因在該菌的全基因組中存在的理論拷貝數(shù)，根據(jù)ddPCR得出金黃色葡萄球菌的實(shí)測(cè)拷貝數(shù)的結(jié)果，計(jì)算出20 μL的體系中存在的拷貝數(shù)，最終的實(shí)測(cè)靈敏度和偏差率按公式（1）、（2）計(jì)算：

實(shí)測(cè)靈敏度=20 μL拷貝數(shù)×18.18

為了驗(yàn)證ddPCR檢測(cè)方法的可行性，將不同濃度的金黃色葡萄球菌進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，分析計(jì)數(shù)結(jié)果與ddPCR檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)溫度優(yōu)化結(jié)果

圖1 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)溫度優(yōu)化結(jié)果Fig. 1 Optimization of ddPCR annealing temperature for detection of Staphyloccocus aureus

設(shè)置金黃色葡萄球菌的PCR程序的退火溫度為55 ℃，梯度差異為5 ℃，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將96 孔板轉(zhuǎn)移到微滴檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)，如圖1所示，50.2 ℃時(shí)微滴數(shù)量和質(zhì)量都較好，所以金黃色葡萄球菌ddPCR的較適退火溫度為50.2 ℃。

圖2 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)特異性結(jié)果Fig. 2 Specificity of ddPCR for detection of Staphyloccocus aureus

2.2 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)特異性結(jié)果將表1所列的供試菌株提取DNA后，用金黃色葡萄球菌的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用微滴檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示，3 株金黃色葡萄球菌被檢測(cè)為陽(yáng)性微滴信號(hào)，而陰性和其他非金黃色葡萄球菌均未出現(xiàn)擴(kuò)增，表明設(shè)計(jì)的金黃色葡萄球菌的引物特異性較強(qiáng)。

2.3 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)靈敏度結(jié)果

圖3 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)靈敏度結(jié)果Fig. 3 Sensitivity of detection of Staphylococcus aureus by ddPCR

金黃色葡萄球菌的活菌培養(yǎng)物的平板計(jì)數(shù)濃度為3.3×106CFU/g，如圖3所示，反應(yīng)1的原始模板濃度太高，無(wú)陰性微滴，數(shù)據(jù)無(wú)效。當(dāng)原始模板濃度為3.3×101CFU/g時(shí)，檢測(cè)出的拷貝數(shù)為0.20 copies/μL，所以，ddPCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)靈敏度為3.3×101CFU/g。

2.4 ddPCR絕對(duì)定量結(jié)果

根據(jù)金黃色葡萄球菌的理論拷貝數(shù)和實(shí)際檢測(cè)結(jié)果拷貝數(shù)計(jì)算出實(shí)測(cè)靈敏度，如表3所示。比較實(shí)測(cè)靈敏度和計(jì)數(shù)靈敏度的差值，當(dāng)實(shí)測(cè)靈敏度大于計(jì)數(shù)靈敏度時(shí)，偏差率為正偏差；當(dāng)實(shí)測(cè)靈敏度小于計(jì)數(shù)靈敏度時(shí)，偏差率為負(fù)偏差。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌的實(shí)測(cè)靈敏度均略高于計(jì)數(shù)靈敏度，且經(jīng)過(guò)偏差率計(jì)算，ddPCR的實(shí)測(cè)靈敏度與計(jì)數(shù)靈敏度偏差率均低于25%，保證了ddPCR進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用的可行性。

表3 拷貝數(shù)和實(shí)測(cè)靈敏度關(guān)系Table 3 Relationship between copy number and measured sensitivity

圖4 金黃色葡萄球菌ddPCR法檢測(cè)靈敏度的線性關(guān)系Fig. 4 Standard curve for sensitivity of ddPCR detection of Staphylococcus aureus

為了驗(yàn)證ddPCR檢測(cè)方法的可行性，將不同濃度的金黃色葡萄球菌進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，分析計(jì)數(shù)結(jié)果與ddPCR檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系。如圖4所示，根據(jù)金黃色葡萄球菌的拷貝數(shù)和菌落濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示R2大于0.99，說(shuō)明ddPCR檢測(cè)酸奶中污染菌的靈敏度線性關(guān)系良好，進(jìn)一步為ddPCR在絕對(duì)定量檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用范圍提供了保障。

3 討 論

Reagent D可以有選擇性地滲透進(jìn)入死菌的細(xì)胞中，在鹵素?zé)舻恼丈湎率筊eagent D的光敏基團(tuán)轉(zhuǎn)化為自由基，并能和DNA分子發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷死菌的DNA分子發(fā)生PCR擴(kuò)增。本研究中采用Reagent D處理細(xì)菌培養(yǎng)液，并與ddPCR技術(shù)相結(jié)合從一定程度上排除了死菌對(duì)檢測(cè)方法的影響，實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)活菌的ddPCR檢測(cè)。

ddPCR方法的結(jié)果判定是根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后微滴檢測(cè)儀收集的發(fā)出熒光信號(hào)的微滴數(shù)量，陽(yáng)性為熒光信號(hào)值高于閾值的反應(yīng)，陰性為熒光信號(hào)值低于閾值的反應(yīng)，然后將陽(yáng)性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)用泊松分布公式計(jì)算出DNA分子的拷貝數(shù)。所以微滴檢測(cè)儀最后收集到的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱直接反映出ddPCR的準(zhǔn)確性和PCR的擴(kuò)增效率。影響PCR擴(kuò)增效率的因素很多，例如引物和探針的濃度，引物的擴(kuò)增效率，合適的退火溫度等。本研究對(duì)這些影響因素都進(jìn)行了優(yōu)化，最終篩選出每一株菌的最佳反應(yīng)條件。

微滴發(fā)生器將配制好的PCR混合液打散并被包裹在微滴發(fā)生專(zhuān)用油中形成微滴，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。模板DNA的濃度對(duì)ddPCR的檢測(cè)結(jié)果有很大的影響。如果模板中的拷貝數(shù)低于所生成的微滴數(shù)量，每一個(gè)微滴中有一個(gè)或沒(méi)有含有目標(biāo)模板的DNA分子，在PCR完成后，含有目標(biāo)模板的微滴發(fā)生擴(kuò)增被微滴檢測(cè)儀檢測(cè)為陽(yáng)性，不含目標(biāo)模板的微滴沒(méi)有擴(kuò)增被檢測(cè)為陰性，根據(jù)這2 種微滴的比例通過(guò)泊松分布可以準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。如果模板中的拷貝數(shù)高于或者接近拷貝數(shù)，該濃度條件下所有的微滴處于飽和狀態(tài)，無(wú)陰性微滴或者陰性微滴的數(shù)量太少，則不能滿(mǎn)足泊松分布的條件，絕對(duì)定量的結(jié)果與真實(shí)值相差太大，則無(wú)法準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)ddPCR的絕對(duì)定量。

金黃色葡萄球菌對(duì)其數(shù)值的過(guò)程控制顯得尤為重要，通過(guò)分析計(jì)數(shù)結(jié)果與ddPCR檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系（標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99），證明了ddPCR用于絕對(duì)定量檢測(cè)的可行性，進(jìn)而為不同濃度污染菌對(duì)終產(chǎn)品造成危害的研究提供了保障，也為ddPCR技術(shù)在其他污染菌和致病菌的檢測(cè)推廣提供理論依據(jù)。

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Quantitative Detection of Staphylococcus aureus in Yogurt by Droplet Digital PCR Assay

ZHOU Wei1, LI Yuehua1, SUN Yong2, LI Yongbo1, ZHANG Tao1, LIU Qiong1, ZHANG Yan1,*, WANG Lixia1,*
(1. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

This study aimed to establish a new accurate quantitative method to detect Staphylococcus aureus in yogurt using droplet digital PCR (ddPCR). Specific primers and probes targeting the nuc gene of Staphylococcus aureus were designed, and the PCR reaction system was optimized. The specificity and sensitivity of ddPCR for detecting the target gene were tested using the DNA extracted viable bacterial cells, and the quantitative results were analyzed. The ddPCR method could be useful to quantitatively detect S. aureus in yogurt with good specificity. The limit of detection (LOD) of the method was 3.3 × 101CFU/g, and the quantitative deviation was +10.18%, which proved the feasibility of using ddPCR for absolute quantitation of S. aureus. It will provide a useful demonstration for standardized control systems of other food-contaminating bacteria and foodborne pathogenic bacteria.

droplet digital PCR; yogurt; detection; Staphylococcus aureus

10.7506/spkx1002-6630-201716046

TS201.3

A

1002-6630（2017）16-0287-05

周巍, 李月華, 孫勇, 等. 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)定量檢測(cè)發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 287-291. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716046. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Wei, LI Yuehua, SUN Yong, et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus in yogurt by droplet digital PCR assay[J]. Food Science, 2017, 38(16): 287-291. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716046. http://www.spkx.net.cn

2016-11-04

科技部公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201510208-08）；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16275506D；17275507D）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAK36B03）

周巍（1983—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：zhouwei0311@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，正高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：snowwinglv@126.com王麗霞（1963—），女，正高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)。E-mail：lisawang9078@vip.sina.com