基于原子力顯微鏡研究p53蛋白與PBR322 DNA的相互作用

陳洋，王艷偉，楊光參

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

基于原子力顯微鏡研究p53蛋白與PBR322 DNA的相互作用

陳洋，王艷偉，楊光參*

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

腫瘤(癌癥)是由于細(xì)胞在復(fù)制過程中，DNA損傷不能修復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞無限增殖而形成的。DNA在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯都會涉及蛋白與DNA的結(jié)合，腫瘤抑制蛋白也是參與這一過程的關(guān)鍵蛋白之一。然而，眾多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制蛋白p53具有識別和修復(fù)損傷DNA的效果，對于細(xì)胞的凋亡、基因的保護(hù)和避免癌癥發(fā)生有著重要的意義。有研究表明，金屬鎂離子和鋅離子可以增強(qiáng)p53蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和p53-DNA的親和力。因此，我們基于原子力顯微鏡(AFM)，直觀地呈現(xiàn)出p53蛋白與PBR322環(huán)狀DNA相互作用的圖像，同時發(fā)現(xiàn)p53蛋白可以使環(huán)狀DNA自身形成聚集或者相交。但是，對于長度相當(dāng)?shù)? 000bp的線狀DNA幾乎沒有這樣的效果，而對于20 000bp DNA不會出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。然而，在高濃度鎂離子環(huán)境下，環(huán)狀DNA會扭轉(zhuǎn)成為麻花狀，即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。這一現(xiàn)象，可為p53蛋白功能和作用機(jī)理研究提供指導(dǎo)，也為癌癥治療、癌癥藥物開發(fā)以及癌癥檢測方法提供啟發(fā)。

p53蛋白；金屬鎂離子；PBR322環(huán)狀DNA；相互作用；DNA超螺旋

目前來說，腫瘤依然難以攻克。腫瘤(癌癥)是由于細(xì)胞在復(fù)制過程中，DNA損傷不能修復(fù)導(dǎo)致的細(xì)胞無限增殖或者細(xì)胞凋亡而形成的[1-6]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在人類惡性腫瘤疾病中，腫瘤細(xì)胞中的p53基因至少有50%發(fā)生了突變[7]。但是，p53蛋白具有識別和修復(fù)損傷DNA的效果，從而達(dá)到抑癌作用。因此，p53蛋白也叫腫瘤抑制蛋白，是參與細(xì)胞復(fù)制的關(guān)鍵蛋白之一，對于細(xì)胞的凋亡、基因的保護(hù)和避免癌癥發(fā)生有著重要的意義[8-9]。

現(xiàn)在，眾多研究者對于p53蛋白的結(jié)構(gòu)都有一致的認(rèn)識，認(rèn)為p53蛋白是由393個殘基構(gòu)成的多域蛋白。這個多域蛋白可分為五部分，分別為：(1)N端域(N-terminal domain，N-ter)-末端轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，能與一系列的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合，調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄功能[10-14]和其與DNA的解離[15]；(2)信號區(qū)，富含脯氨酸，有5個脯-X-X-脯重復(fù)順序，此區(qū)不是轉(zhuǎn)錄活化區(qū)所必須的，但對誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是必須的；(3)DNA特異性結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)，也叫核心域(core domain)，可以特異性結(jié)合到DNA[16]；(4)四聚化域(tetramerization domain，Tet)；(5)C端域(C-terminal domain，C-ter)部分與DNA 非特異性結(jié)合[1，7，17]。學(xué)者們對于p53-DNA相互作用也提出了兩個滑動搜索機(jī)制：(1)一維滑動模式。p53蛋白持續(xù)與DNA保持接觸形式，沿著DNA滑動擴(kuò)散[18-22]。(2)“Hopping”模式和“Jumping”模式。Hopping模式，是p53蛋白在一條DNA上跳躍行走。Jumping模式，是p53蛋白從一條DNA上跳躍到另外一條DNA上，這種情況很少發(fā)生[23-24]。一直以來，大家關(guān)注最多的是p53蛋白在DNA上的滑動機(jī)制。然而，p53蛋白與DNA相互作用的機(jī)制還沒有完全被搞清楚?？梢酝ㄟ^p53蛋白與DNA相互作用的結(jié)果推演其作用機(jī)制，為完善此作用機(jī)制提供可能和方向。

金屬離子對于p53-DNA相互作用也有一定影響。比如一些有毒的離子(如汞、鎘、銅等)可以結(jié)合到p53蛋白，破壞p53蛋白的結(jié)構(gòu)和p53蛋白與DNA的親和力。再比如鎂和鋅離子等可以增強(qiáng)p53蛋白的結(jié)構(gòu)和p53蛋白與DNA的親和力[25-26]。

在本文中，我們基于AFM掃描p53蛋白與PBR322 DNA相互作用的圖像，直觀地展現(xiàn)了p53與環(huán)狀DNA的相互作用結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白可以使環(huán)狀DNA自身形成聚集或者相交。而對于5 000bp DNA的效果很不明顯，對于20 000bp DNA則沒有這樣的現(xiàn)象。此外，也發(fā)現(xiàn)在高濃度鎂離子環(huán)境下，環(huán)狀DNA會扭轉(zhuǎn)成為麻花狀，即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。這一現(xiàn)象，可以為p53蛋白功能和作用機(jī)理研究提供啟示，也希望為癌癥治療、癌癥藥物開發(fā)以及癌癥檢測方法提供啟示。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料和樣品制備

1.1.1 人類全長p53蛋白和PBR322 DNA以及相關(guān)材料

實驗使用的人類全長p53蛋白購自美國Sigama-Aldrich公司，其母液濃度為200 ～ 600 ng/μL。P53蛋白母液包含50 mmol/L磷酸鈉和50 mmol/L氯化鈉，pH為7.5。P53蛋白的重組與表達(dá)都是通過大腸桿菌生產(chǎn)，并且通過SDS-PAGE方式檢測得知，其純度至少達(dá)到90%。實驗使用的PBR322 DNA(4 000bp，環(huán)狀)/5 000bp DNA/20 000bp DNA(NoLimits，F(xiàn)ermentas/Thermo Fisher Scientific， Burlinton， Ontario ，Canada)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，直接使用，沒有經(jīng)過再次純化處理，其出廠時的母液濃度為500 ng/μL。溶液環(huán)境為1×TE 緩沖液，此緩沖液由10 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA組成，pH為7.6。配制緩沖液使用的去離子水是Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司生產(chǎn))制備的，其中水的電導(dǎo)率小于1×10-6Ω-1cm-1。云母片被切成1.0 ～ 1.5 cm2正方形，在使用時即撕即用。其他實驗用藥品(比如Tris、氯化鎂等)均購自美國Sigma-Aldrich公司。

緩沖液pH是通過添加鹽酸調(diào)節(jié)到7.5的狀態(tài)，其pH的測量使用的是Sartorius Basic pH Meter PB-10。

1.1.2 AFM樣品制備

DNA對照組樣品的制備。DNA對照組中藥品是用500 ng/μL的DNA母液在5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2溶液(pH為7.5)中培育得到的。通常地，加入二價陽離子是用來將帶負(fù)電的DNA吸附到帶負(fù)電的云母片上[27- 28]。在此，鎂離子不僅起到吸附作用，而且也是研究對象之一。取0.4 μL DNA母液與119.6 μL 5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)緩沖液混合，形成DNA濃度為1 ng/μL的溶液200 μL，然后，充分混合均勻，再冰浴30 min。之后，取30 μL的DNA對照組溶液滴到剛撕好的云母片(1 cm×1 cm)上，沉積3 min，使DNA粘附到云母片上。然后用50 μL的去離子水輕輕沖洗15次左右，以便沖去多余的雜質(zhì)分子。再用氮氣輕輕地吹干，之后用AFM掃描成像。如圖1所示。

圖1 AFM樣品制備流程圖Fig.1 Flow chart of AFM sample preparation

P53-DNA復(fù)合物對照組樣品制備，操作方法與DNA對照組樣品制備一致，只是p53蛋白與DNA的配比不同。把p53蛋白和DNA濃度配比調(diào)制為2∶1，即p53蛋白濃度為2 ng/μL，DNA濃度為1 ng/μL。

1.2 實驗儀器、方法和數(shù)據(jù)處理

實驗時使用的AFM是購自德國JPK公司的NanoWizardⅢ AFM，配置有一個NanoWizard AFM 自動機(jī)器人和一臺控制器，還有控溫系統(tǒng)BioScience和NanoScience系統(tǒng)。使用的探針是NanoWorld公司生產(chǎn)的NCHR-50型探針，其詳細(xì)參數(shù)為：懸臂長為125 μm，寬度為30 μm ，厚度為4 μm ，彈性系數(shù)為42 N/m，共振頻率為320 kHz，硅質(zhì)鍍鋁。將制作好的樣品，放置在AFM操作臺上，在常溫下的空氣中用AC mode(即輕敲模式、非接觸模式)模式掃描樣品。掃描尺寸為1.5 μm × 1.5 μm，掃描線率為1.0 Hz。對于每一個樣品，都選取不同的區(qū)域進(jìn)行掃描，這樣可以減小溶液不均勻帶來的誤差。

得到的每張圖的像素為512×512。使用4.2版本的JPK Data Processing軟件對原圖進(jìn)行相應(yīng)且一致的處理，使用Image J軟件對圖像排版和編輯。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 p53蛋白與PBR322 DNA的AFM成像結(jié)果

使用AFM掃描得到Tris緩沖液培育的PBR322 DNA圖像，發(fā)現(xiàn)這些DNA形貌保持一致。如圖2a對照組PBR322 DNA AFM圖像，PBR322 DNA形貌都呈現(xiàn)自由舒展?fàn)顟B(tài)。其中，溶液環(huán)境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL。有時由于去離子水的沖洗，留存在云母片上的DNA形貌有些改變，但是，所有圖像中DNA呈現(xiàn)的形貌基本保持自由舒展?fàn)顟B(tài)，這是因為DNA本身帶負(fù)電導(dǎo)致的[28-29]。

圖2b為p53-PBR322 DNA聚合物的AFM圖像。其中，溶液環(huán)境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，p53濃度為2 ng/μL，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL?？梢悦黠@看到PBR322 DNA由于p53蛋白粘附于環(huán)上的兩個點，致使PBR322 DNA出現(xiàn)兩個環(huán)或者更多環(huán)的現(xiàn)象，其自身交點增多，甚至有的直接聚集為棒狀。出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，是由于p53蛋白與DNA的靜電相互作用導(dǎo)致的。這也許是聚集的p53蛋白各自的C端分別粘附同一條DNA的不同位置所致。

眾所周知，二價鎂離子不能使DNA發(fā)生凝聚[30]。Liu等[31]的研究表明金屬離子可以增強(qiáng)組蛋白與DNA的自組裝現(xiàn)象。在他們的實驗中，金屬鎂離子具有增強(qiáng)組蛋白和DNA自組裝的作用；鈣離子卻具有不一樣的效果。在我們的實驗中，金屬鎂離子也呈現(xiàn)了同樣的效果。我們把緩沖液中鎂離子的濃度變?yōu)?0 mmol/L，即緩沖液為5 mmol/L Tris 20 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，用AFM掃描此緩沖液條件下培育的p53蛋白與PBR322 DNA混合物。培育混合物時，p53蛋白濃度為2 ng/μL，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL。我們發(fā)現(xiàn)PBR322環(huán)狀DNA上的結(jié)點會更多，甚至出現(xiàn)麻花狀扭轉(zhuǎn)(如圖2c所示)。這樣的現(xiàn)象表明，高濃度的鎂離子可以促進(jìn)p53蛋白與DNA凝聚現(xiàn)象，這也許是由于高濃度鎂離子增強(qiáng)了p53蛋白與DNA的親和力所致。

圖2 p53蛋白與PBR322 DNA AFM圖像(高度圖，1.5 μm ×1.5 μm)。Fig.2 AFM images of PBR322 DNA and p53 protein (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

2.2 p53蛋白與5 000bp和20 000bp DNA的AFM成像結(jié)果

使用AFM掃描Tris緩沖液分別培育的5 000bp DNA和20 000bp DNA，在AFM圖像中這些DNA形貌基本一致，都呈現(xiàn)自由舒展?fàn)顟B(tài)(如圖3a、c所示)。其中，溶液環(huán)境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，DNA濃度為1 ng/μL。但是，對于5 000bp DNA來說，自身很少出現(xiàn)環(huán)狀或者交叉現(xiàn)象；對于20 000bp DNA，自身卻很容易出現(xiàn)交叉或疊加，進(jìn)而呈現(xiàn)出環(huán)狀。這是由于20 000bp DNA比較長，自身重力比靜電相互作用力更強(qiáng)，從而導(dǎo)致交叉或疊加現(xiàn)象。而5 000bp DNA長度比較短，靜電相互作用起主導(dǎo)作用。

如圖3b、d所示，可以清晰看到5 000bp DNA和20 000bp DNA上都粘附有p53蛋白。其中，溶液環(huán)境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，p53濃度為2 ng/μL，DNA濃度為1 ng/μL。圖3b中，p53蛋白多同時結(jié)合兩條DNA，很少出現(xiàn)一條DNA呈環(huán)狀的情況。甚少有區(qū)別于圖3a中的成環(huán)現(xiàn)象。也就是說，p53蛋白可以使5 000bp DNA成環(huán)或者交叉出現(xiàn)，但是效果很不明顯。

從圖3c、d中，可以明顯看到20 000bp DNA的形貌沒有變化，成環(huán)和交叉現(xiàn)象一致。主要區(qū)別在于圖3d中DNA上有p53蛋白，而圖3c中的DNA上沒有。因此，我們認(rèn)為p53蛋白不能誘使較長的鏈狀DNA成環(huán)或者交叉。

圖3 p53蛋白與5 000bp DNA和20 000bp DNA的AFM圖像(高度圖，1.5 μm ×1.5 μm)。 Fig.3 AFM images of p53 protein and 5 000bp DNA/20 000bp DNA (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

3 結(jié)論

在p53蛋白與PBR322 DNA相互作用的AFM圖像中，可以直觀地看到p53與環(huán)狀DNA的相互作用結(jié)果。在鎂離子濃度為3 mmol/L，并且沒有p53蛋白時，可以很直觀地看到PBR322環(huán)狀DNA都呈現(xiàn)自由的環(huán)狀，基本沒有相交現(xiàn)象出現(xiàn)。當(dāng)加入p53蛋白時，環(huán)狀DNA自身形成聚集或者相交，即環(huán)狀DNA自身出現(xiàn)更多的環(huán)，有的甚至呈現(xiàn)棒狀。對于5 000bp DNA有類似效果，卻很不明顯，對于20 000bp DNA沒有這樣的現(xiàn)象。但是，在高濃度(20 mmol/L)鎂離子環(huán)境下，環(huán)狀DNA會扭轉(zhuǎn)成為麻花狀，甚至出現(xiàn)超螺旋。我們認(rèn)為，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)有兩方面的原因：一個是p53蛋白與DNA間相互靜電的作用，另一個是高濃度鎂離子增強(qiáng)了p53蛋白與DNA之間的親和力。鎂離子可以與p53殘基結(jié)合，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且可以增加殘基電荷量，使其可以與帶負(fù)電的DNA有更強(qiáng)的靜電相互作用力[25-26]。

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Study on interaction between p53 protein and PBR322 DNA based on atomic force microscopy

CHEN Yang, WANG Yan-wei, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, 325035, China)

∶Tumor (cancer) is caused by the apoptosis or proliferation of cells when DNA damage cannot be repaired in time in the process of replication. The processes of DNA transcription and expression are all involved in the interaction of protein and DNA in living cells. And, tumor suppressor protein is also one of the key proteins involved in this process. However, many studies have found that the tumor suppressor protein p53 can recognize and repair damaging-DNA, which plays a significant role in cell apoptosis, gene protection and avoidance of cancer. Studies have shown that the structural stability of p53 protein and the affinity of p53-DNA can be enhanced by metal ions, such as magnesium and zinc ions. Therefore, based on atomic force microscopy (AFM), the interaction image of p53 protein and PBR322 ring DNA is visually presented. And, it is found that p53 protein can promote a ring DNA aggregation or cross in itself. However, this phenomenon occurrence is rare for linear DNA with the length of 5 000bp, and it is not occurrence in 20 000bp DNA either. However, protein p53 can make ring DNA to be a twist shape in high magnesium concentration solution, that is, the supercoil shape is formed. This phenomenon may provide guidance for the study on the function and mechanism of protein p53, as well as provide insights into cancer therapy, cancer drug development and cancer detection methods.

∶ protein p53；metal magnesium ions；PBR322 ring DNA；interaction；DNA supercoil

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.017

2017-03-22

國家自然科學(xué)基金(11274245, 10974146, 11304232)；溫州大學(xué)創(chuàng)新基金(3162015033)

陳洋(1990—)，男，碩士研究生，研究方向為生命現(xiàn)象中的凝聚態(tài)物理。E-mail: speedmatrix2006@126.com

*通信作者，楊光參。E-mail: yanggc@wzu.edu.cn

Q71

A

1002-4026(2017)04-0106-06