趙穎 遲江瑞 趙洪猛 張斌 余岳 曹旭晨

·基礎(chǔ)研究·

阿法替尼對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究*

趙穎 遲江瑞 趙洪猛 張斌 余岳 曹旭晨

目的：探討酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）阿法替尼（afatinib）對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，并就阿法替尼與吉非替尼（gefitinib）對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用進(jìn)行比較。方法：應(yīng)用MTT法檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、MDAMB-231細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)的PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期變化以及Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：阿法替尼對(duì)MCF-7、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞均有明顯的抑制作用，IC50分別為0.101、0.141、0.887 μmol/L。阿法替尼對(duì)T47D、MDA-MB-231細(xì)胞作用24 h后G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，細(xì)胞凋亡率增加，晚期的凋亡率分別為88.9%、58.1%，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡通路蛋白PARP、caspase-3發(fā)生剪切。阿法替尼、吉非替尼使MDA-MB-231細(xì)胞的EGFR磷酸化水平受到明顯抑制，相同濃度下，阿法替尼作用較吉非替尼更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。結(jié)論：阿法替尼可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，且具有明顯的量效關(guān)系，較吉非替尼具有更有效的作用。

乳腺癌 阿法替尼 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡

阿法替尼（afatinib）為EGFR、HER-2的非可逆雙靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），可與EGFR的Cys773位點(diǎn)及HER-2的Cys805位點(diǎn)結(jié)合。阿法替尼已于2013年通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療EGFR突變陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌，而對(duì)乳腺癌作用的研究較少。本研究旨在研究阿法替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用，并與單靶點(diǎn)EGFR可逆性TKI吉非替尼（gefitinib）進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

阿法替尼、吉非替尼購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司；RPMI 1640、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Annexin V/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司；EGFR、磷酸化EGFR、多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、caspase-3抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231由天津市腫瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7、T47D細(xì)胞由含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，MDA-MB-231細(xì)胞由含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.2.2MTT法檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，將不同抑制劑按照不同濃度梯度加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（200 μL/孔），以含等體積濃度DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。不同抑制劑作用24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，孵育4 h，離心棄上清。每孔加入DMSO 200 μL，震蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度（OD）值。參照文獻(xiàn)［1］，計(jì)算不同抑制劑對(duì)細(xì)胞的抑制率，采用Excel繪制抑制率曲線分別計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。細(xì)胞的抑制率=（D對(duì)照組-D實(shí)驗(yàn)組）/D對(duì)照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后，將不同抑制劑按照不同濃度梯度加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以含等體積濃度DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照。不同抑制劑作用24 h后收集細(xì)胞，使用4℃預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次，離心棄上清。加入冰預(yù)冷的70%乙醇4℃固定2 h。離心棄上清，PBS緩沖液洗滌1次，離心棄上清，加入1 mL PI染液避光孵育10 min，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。取細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液。各組分別取100 μL細(xì)胞懸液至5 mL測(cè)試管中，分別加入5 μL的Annex?in-V標(biāo)記液和5 μL的PI，避光室溫孵育15 min，加入500 μL結(jié)合緩沖液，4℃靜置30 min，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定。

1.2.4 Western blot法細(xì)胞處理后，使用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，棄上清，加入細(xì)胞裂解液，冰上靜置30 min，收集細(xì)胞裂解液，4℃下12 000 r/min離心5 min后收集上清，95℃加熱15 min。利用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，加入相應(yīng)體積加樣緩沖液，95℃加熱10 min。每組取40 μg蛋白于10%SDS-PAGE中進(jìn)行蛋白電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，將硝酸纖維素膜置于一抗稀釋液中4℃孵育過(guò)夜。用含0.1%Tween20的PBS緩沖液洗滌3次，置于二抗稀釋液中室溫孵育1 h，再次使用含0.1%Tween20的PBS緩沖液洗滌3次。加入化學(xué)底物發(fā)光液，暗室曝光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞系EGFR、HER-2表達(dá)

通過(guò)Western blot法檢測(cè)MDA-MB-231、MCF-7、T47D細(xì)胞中EGFR、HER-2表達(dá)情況，結(jié)果提示MDAMB-231、T47D細(xì)胞中EGFR陽(yáng)性、HER-2陰性，而MCF-7細(xì)胞中EGFR弱陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性（圖1）。

圖1 MDA-MB-231、MCF-7、T47D細(xì)胞EGFR、HER-2表達(dá)情況Figure 1Expression levels of EGFR and HER-2 in MDA-MB-231,MCF-7,and T47D cell lines

2.2 阿法替尼、吉非替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231、MCF-7、T47D三種乳腺癌細(xì)胞系中，MCF-7、T47D細(xì)胞對(duì)阿法替尼的抑制作用最為敏感，IC50分別為0.101、0.141 μmol/L，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖也可明顯被阿法替尼抑制（IC50=0.887 μmol/L）。與阿法替尼相比，三種乳腺癌細(xì)胞系對(duì)吉非替尼的敏感性均較差，T47D、MDA-MB-231細(xì)胞IC50分別為10.375、19.340 μmol/L，均表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，而MCF-7細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥，IC50＞20μmol/L（圖2）。

2.3 阿法替尼、吉非替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定阿法替尼、吉非替尼對(duì)T47D、MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明阿法替尼、吉非替尼作用T47D、MDA-MB-231細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期及G2期細(xì)胞明顯減少，阿法替尼較吉非替尼的抑制作用明顯增強(qiáng)（圖3）。

2.4 阿法替尼、吉非替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)阿法替尼、吉非替尼對(duì)T47D、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明1 μmol/L吉非替尼作用T47D、MDA-MB-231細(xì)胞后，早期的凋亡率分別為54.6%、60.4%，晚期的凋亡率分別為21.4%、12.4%；1 μmol/L阿法替尼作用T47D、MDA-MB-231細(xì)胞后，早期的凋亡率分別為6.0%、24.3%，晚期的凋亡率分別為88.9%、58.1%（圖4）。

圖2 不同濃度阿法替尼、吉非替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞系抑制率曲線Figure 2Inhibition ratio curves of breast cancer cell lines under afatinib and gefitinib at different concentrations

2.5 阿法替尼、吉非替尼對(duì)EGFR磷酸化水平及凋亡通路的影響

通過(guò)Westren blot法檢測(cè)阿法替尼、吉非替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的EGFR磷酸化水平的影響及持續(xù)效果顯示，10 μmol/L的阿法替尼、吉非替尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用3 h后，經(jīng)100 nmol/L表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）刺激10 min，EGFR磷酸化水平受到明顯抑制。洗脫后6 h，經(jīng)100 nmol/L EGF刺激10 min，阿法替尼處理組的EG?FR磷酸化水平仍受到明顯抑制，而吉非替尼處理組的EGFR磷酸化水平明顯升高（圖5A）。Western blot法檢測(cè)阿法替尼、吉非替尼對(duì)T47D、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡通路蛋白PARP、Caspase-3的影響結(jié)果表明，1 μmol/L的阿法替尼、吉非替尼均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡通路蛋白PARP、Caspase-3發(fā)生剪切，而相同濃度的阿法替尼較吉非替尼作用更強(qiáng)（圖5B）。

圖3 阿法替尼、吉非替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響Figure 3Effect of afatinib and gefitinib on breast cancer cell cycles

圖4 阿法替尼、吉非替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 4Effect of afatinib and gefitinib on breast cancer cell apoptosis

圖5 阿法替尼、吉非替尼對(duì)EGFR磷酸化水平及凋亡通路的影響Figure 5Effect of afatinib and gefitinib on phosphorylation of EGFR and apoptosis signal pathway

3 討論

目前，曲妥珠單抗靶向治療已成為HER-2陽(yáng)性乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療［2］。但對(duì)于HER-2陰性乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌，尚未發(fā)現(xiàn)明確有效的治療靶點(diǎn)［3］。盡管HER-2陽(yáng)性及Luminal型乳腺癌對(duì)于曲妥珠單抗及內(nèi)分泌治療具有較好的療效，但耐藥仍是其治療的棘手問(wèn)題［4］。因此，尋找有效的靶點(diǎn)及新的靶向治療藥物成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)。在肺癌、頭頸部腫瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中，EGFR的作用受到廣泛關(guān)注［5］，乳腺癌中14%～91%為EGFR高表達(dá)［6］，而EGFR高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)［7］。尤其是在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移常見(jiàn)、預(yù)后最差的三陰性乳腺癌中，50%以上患者的EGFR表達(dá)呈陽(yáng)性［8］。因此，針對(duì)EGFR的靶向治療可能為乳腺癌治療帶來(lái)新的希望。吉非替尼是一種EGFR酪氨酸激酶小分子抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ATP抑制EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)的傳遞。在肺癌治療中吉非替尼已得到廣泛的應(yīng)用，并取得了一定的療效［9］。對(duì)經(jīng)其他治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，吉非替尼的Ⅱ期臨床試驗(yàn)的早期結(jié)果未顯示有效性，尤其是對(duì)曾行化療的患者［10］。因此，在乳腺癌中對(duì)吉非替尼的原發(fā)性耐藥可能普遍存在。阿法替尼是第二代高效雙重非可逆性的TKI，可與EGFR的Cys773位點(diǎn)及HER-2的Cys805位點(diǎn)進(jìn)行不可逆結(jié)合，從而阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。目前，阿法替尼已用于非小細(xì)胞肺癌治療，但在乳腺癌治療中的應(yīng)用仍在研究之中。

本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)表明，阿法替尼可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的活性，且具有明顯的量效關(guān)系。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，阿法替尼可抑制乳腺癌細(xì)胞于G0/G1期，從而阻斷乳腺癌細(xì)胞的增殖。Schütze等［12］研究了阿法替尼對(duì)人鱗狀細(xì)胞癌的作用發(fā)現(xiàn)，阿法替尼同樣可阻滯癌細(xì)胞于G0/G1期，并且有一定的放療增敏作用。阿法替尼可通過(guò)不可逆結(jié)合EGFR及HER-2受體，抑制其磷酸化，而PI3K/Akt是生長(zhǎng)因子受體重要的下游信號(hào)分子，可促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。因此，阿法替尼主要通過(guò)抑制EGFR/PI3K/Akt通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的作用［13］。caspase-3是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中重要的凋亡執(zhí)行分子，PARP是一種DNA修復(fù)酶，可被cas?pase-3剪切而失活，為caspase-3激活的重要指標(biāo)。本研究進(jìn)一步通過(guò)Annexin-V/PI雙染法發(fā)現(xiàn)，阿法替尼阻斷乳腺癌細(xì)胞增殖后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阿法替尼促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞caspase-3及PARP的剪切。因此，阿法替尼可通過(guò)caspase途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

阿法替尼的藥物作用較吉非替尼有以下優(yōu)勢(shì)：1）作用癌細(xì)胞廣泛：因阿法替尼是一種多靶點(diǎn)抑制劑，因此可針對(duì)多種乳腺癌細(xì)胞類型；2）作用相應(yīng)更強(qiáng)：相較于吉非替尼，阿法替尼IC50更低，相同濃度下其對(duì)癌細(xì)胞抑制作用更顯著；3）作用時(shí)間更久：因阿法替尼是一種不可逆的抑制劑，其信號(hào)阻斷時(shí)間更長(zhǎng)，經(jīng)洗脫后仍可抑制EGFR的磷酸化。Ninomiya等［14］利用小鼠肺癌模型，比較阿法替尼與吉非替尼的藥物作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿法替尼可顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，驗(yàn)證了阿法替尼較吉非替尼的治療優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，阿法替尼可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，相較吉非替尼具有更有效的作用。因此，阿法替尼對(duì)于乳腺癌治療可能具有較好的前景，但需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

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（2017-04-11收稿）

（2017-07-05修稿）

Effect of afatinib on the proliferation and apoptosis of human breast cell lines and its mechanisms

Ying ZHAO,Jiangrui CHI,Hongmeng ZHAO,Bin ZHANG,Yue YU,Xuchen CAO

Xuchen CAO;E-mail:cxc2017@126.com
The First Department of Breast Cancer,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81372843)

Objective:To investigate the effect of afatinib,a tyrosine kinase inhibitor,on the proliferation,cell cycle,and apoptosis of human breast cell lines,and compare its effects with those of gefitinib.Methods:Three human breast cell lines,MCF-7,T47D,and MDA-MB-231,were cultured as cell models.A methyl thiazolyl tetrazolium assay was utilized to measure cell viability.Flow cytometer was used to analyze the cell cycle arrest(PI staining)and apoptosis rates(Annexin-V/PI staining).The protein expression was detected by Western blot analysis.Results:The proliferation of three human breast cell lines was significantly inhibited by afatinib,and the IC50levels of MCF-7,T47D,and MDA-MB-231 were 0.101,0.141,and 0.887 μmol/L,respectively.The G0/G1phase cell ratio increased considerably 24 h after afatinib was added to T47D or MDA-MB-231.The cell apoptosis rate also increased in the two cell lines(88.9%and 58.1%).The cleavage of apoptosis pathway proteins PARP and caspase-3 was also promoted by afatinib.Phosphorylation of EGFR was significantly inhibited by afatinib in the MDA-MB-231 cell line.Finally,the inhibition effect of afatinib was stronger than that of gefitinib.Conclusion:Afatinib could significantly inhibit the proliferation of breast cancer cells and promote apoptosis.The effect was dose-dependent.Afatinib was a more effective tyrosine kinase inhibitor as compared with gefitinib.

breast neoplasm,afatinib,cell cycle,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.15.422

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺一科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81372843）資助

曹旭晨cxc2017@126.com

趙穎專業(yè)方向?yàn)槿橄倌[瘤臨床治療及腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制等基礎(chǔ)研究。

E-mail：zhaoyingtjmu@126.com