李洪艷，趙 剛

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑的研究

李洪艷，趙 剛

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

佐劑與抗原混合后注射動物體內，能非特異性改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發(fā)揮其輔佐作用。凡是可以增強抗原特異性免疫應答的物質均可稱為佐劑。目前新城疫滅活疫苗的佐劑免疫增強效果不理想，亟待開發(fā)一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑。試驗對雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑進行研究，結果表明，佐劑溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最優(yōu)，且用此佐劑制成的雞新城疫滅活疫苗，疫苗免疫效果明顯提高。

免疫佐劑；雞新城疫滅活疫苗；制備

免疫佐劑其功能是與抗原混合后注射于動物體內，能非特異性改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發(fā)揮其輔佐作用。佐劑的種類非常多，常規(guī)佐劑包括鋁鹽類、油乳劑、蜂膠佐劑。最常見的佐劑為油類佐劑，這類佐劑通常具有良好的免疫增強作用。但是，目前新城疫滅活疫苗的佐劑免疫增強效果不理想，亟待開發(fā)一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑[1-5]。本文對雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑進行系統(tǒng)的研究，為制備高效的雞新城滅活疫苗奠定基礎。

1 試驗材料與動物

新城疫病毒La Sota株，購自中國獸藥監(jiān)察所，HA效價為28，-20℃保存?zhèn)溆?；鹽酸左旋咪唑注射液，白油佐劑購自美國索諾邦公司；30日齡SPF雞，整個飼養(yǎng)過程均在公司生產的隔離器中進行，飼料經(jīng)高壓滅菌，水為酸化水。采血用試驗雞為成年SPF公雞。

2 試驗方法

2.1 佐劑的制備

高濃度母液的配制：用市售的左旋咪唑含量為50 mg·mL-1的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母液，將其過濾除菌后備用。配制低濃度佐劑溶液：取50 mg·mL-1的左旋咪唑母液4 mL與白油佐劑96 mL混合均勻，即為每mL溶液中含有左旋咪唑為2 mg的疫苗佐劑。

2.2 佐劑組分篩選試驗

A組左旋咪唑與弗氏佐劑；B組左旋咪唑與皂苷；C組左旋咪唑與白油；D組白油與卡波姆（樹脂）；E組白油與黃芪多糖。

試驗數(shù)據(jù)表明，C組（即左旋咪唑與白油組成的佐劑）的效果最好，表明這兩種成分有協(xié)同增效作用。

表1 不同佐劑接種后動物的臨床反應

表2 免疫后HI效價檢測結果

2.3 雞新城疫滅活疫苗的制備

2.3.1 新城疫病毒在雞胚上增殖

將新城疫病毒La Sota株用滅菌生理鹽水分別各作10～5倍稀釋，各接種9～10日齡SPF胚10枚，0.1 mL·枚-1，接種后密封針孔，置于37℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。將在48 h前死亡的雞胚棄去，48 h后，每4～8 h照胚1次，死亡的雞胚隨時取出，直至120 h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻。將冷卻4～24 h的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術去除擬定部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛屑囊膜及羊膜，收集48～120 h死亡和120 h后的活胚的尿囊液，單胚單收，并分別測定每胚的HA效價及混合后原液的EID50。

2.3.2 新城疫滅活疫苗的制備

將滅活并檢驗合格的雞胚尿囊液混于同一容器內，先加入5%體積的吐溫-80，充分搖勻，至吐溫-80完全融解；再按l∶1.5體積分別加入本試驗實施例1至3制備的佐劑或者加入白油佐劑，充分乳化后，取1支潔凈吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，不擴散，判為合格。充分搖勻后，定量分裝，置2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 新城疫滅活疫苗安全性試驗

用10～14日齡SPF雞10只，頸部皮下接種新城疫滅活疫苗1.0 mL，觀察14 d，應不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部或全身反應。

2.4 動物免疫效果試驗

為了排除免疫抗原量對免疫效果的影響，將經(jīng)SPF雞胚擴增的病毒液與含不同濃度左旋咪唑的白油佐劑，分別制備成油乳劑滅活苗，各組免疫相同劑量0.02 mL·只-1，免疫方式為頸部皮下注射，觀察免疫及保護效果。

試驗動物分組：A-表示胚毒與實施例1制備的每mL溶液中含2 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；B-表示胚毒與實施例2制備的每mL溶液中含5 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；C-表示胚毒與實施例3制備的每mL溶液中含10 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；D-表示胚毒與不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；NC-空白對照組。每組10只SPF雞，同時留5只不免疫作為對照組。免疫前采血，HI抗體檢測均為陰性。分別在免疫后第7、14、21天翅下靜脈采血，分離血清，用HI方法測定血清抗體效價。

2.4.1 免疫雞淋巴細胞增殖試驗

試驗期間每周每組隨機剖殺2只雞，取脾做淋巴細胞增殖試驗，以特異性全病毒蛋白刺激脾淋巴細胞，觀察淋巴細胞增殖情況。淋巴細胞增殖試驗參照淋巴細胞增殖試驗CCK-8試劑盒說明書進行。

雞脾淋巴細胞的制備：取SPF雞靜脈注射空氣處死后，放入70%酒精中浸泡5 min；之后無菌手術開腹，取出脾臟，放于加有不完全RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中；將脾臟剪碎放在銅網(wǎng)上，用注射器針芯擠壓研磨脾臟；取出銅網(wǎng)，反復吹吸幾次后，將脾細胞懸液轉移到50 mL離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30 mL，混勻，1 500 r·min-1、4℃離心6 min，棄上清；然后向細胞沉淀中加入10 mL紅細胞裂解液，重懸，37℃裂解5 min后，1 500 r·min-1、4℃離心6 min，棄上清；細胞沉淀用10 mL含3%血清的Hank's液洗滌2次；用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將制備好的脾淋巴細胞懸液調整至2×106個·mL-1后，加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL。每只雞脾淋巴細胞分別設9孔，其中3孔加入20 μL純化的新城疫病毒作為特異性刺激抗原作為試驗孔，終濃度為5 μg·mL-1；3孔不加入任何刺激抗原作為細胞增殖的本底對照，3孔加入終濃度為20 μg·mL-1的刀豆球蛋白A（ConA）作為陽性對照；37℃5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)60 h；加入10 μL的CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm波長測量各孔的吸光度，計算刺激指數(shù)。

刺激指數(shù)（SI）=試驗組OD均值/相應本底OD均值。

2.4.2 雞γ干擾素檢測

取制備好的脾淋巴細胞懸液加至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔3 mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5 d后移取細胞懸液，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，4℃暫存?zhèn)溆谩２捎秒p抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測雞γ干擾素（IFN-γ），具體操作按雞IFN-γELISA檢測試劑盒使用說明書進行。向預先包被IFN-γ抗體的包被微孔中依次加入樣品、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌后用底物TMB顯色。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。

IFN-γ檢測操作步驟：從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；設置標準品孔、樣本孔、空白孔。標準品孔各加濃度為0、5、10、20、40、80 pg · mL-1的標準品50 μL；樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL（樣品最終稀釋度為5倍），空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封板后置37℃恒溫箱溫育60 min；小心揭掉封板膜，棄去液體，吸水紙上甩干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上甩干，如此重復洗板5次；每孔先加入底物A 50 μL，再加入底物B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光孵育15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應，15 min內在450 nm波長下測量各孔的吸光度；在Excel工作表中，以標準品的濃度為橫坐標，對應OD450nm值為縱坐標，繪出標準品線性回歸曲線，計算出標準曲線的直線回歸方程式；將樣品的OD450nm值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5），即為樣品的實際濃度。

3 試驗結果

3.1 新城疫病毒的效價測定

經(jīng)測定，新城疫病毒EID50為108.3/0.1 mL＞108.0/0.1 mL，HA為29，符合制苗要求。

3.2 免疫效果檢測

不同試驗組在免疫后不同時間的抗體水平見表3。

疫苗免疫后，雞群外觀、食欲均正常，無不良反應，接種部位無紅腫現(xiàn)象，吸收效果良好，表明含左旋咪唑的雞新城疫滅活疫苗對雞只安全。血清抗體效價結果表明，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的HI抗體平均水平均明顯高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對照組。

表3 不同試驗組在免疫后不同時間的抗體水平

3.3 免疫雞淋巴細胞增殖試驗

淋巴細胞增殖試驗結果見表4。由表4結果可知，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細胞數(shù)均高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對照組；含5或10 mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細胞數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）。表明左旋咪唑可促進雞淋巴細胞增殖，刺激機體產生較強的細胞免疫。

表4 雞免疫后脾淋巴細胞增殖反應

3.4 干擾素檢測

IFN-γ標準曲線的直線回歸方程式為：y=0.0156x R2=0.9885。換算出不同ND疫苗免疫后各組脾淋巴細胞中IFN-γ含量，結果見表5。

表5 免疫后各組脾淋巴細胞中IFN-γ含量 pg ·mL-1

表5結果表明，含左旋咪唑5或10 mg的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細胞中IFN-γ含量均明顯高于其它免疫組；含左旋咪唑10 mg的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細胞中IFN-γ含量最高。表明左旋咪唑可增強雞新城疫滅活疫苗的免疫功能，延長疫苗免疫保護期。

4 結論

將左旋咪唑與白油佐劑按照不同用量配比制成的佐劑，通過試驗數(shù)據(jù)表明，只有佐劑溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最優(yōu)，且用此佐劑制成的雞新城疫滅活疫苗，疫苗免疫效果明顯提高，為制備高效的雞新城滅活疫苗奠定了基礎。

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Study on Immune Adjuvant Inactivated Newcastle Disease Vaccine

LI Hongyan,ZHAO Gang
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Adjuvant mixed with antigens after injection in the animal,can enhance the body or non-specific changes of specific immune response to the antigen,play its supporting role.Any substance that enhances the antigenspecific immune response can be called an adjuvant.However,current adjuvant Newcastle disease inactivated vac?cine enhancement effect is not ideal,the need to develop a suitable Newcastle disease inactivated vaccine adjuvant.The paper studied the immune adjuvant of chicken Newcastle disease inactivated vaccine,the result showed that the best content of levamisole in a adjuvant solution was 2～10 mg· mL-1.Newcastle disease inactivated vaccine which was made with this adjuvant could increase vaccine immunization effect obviously.

adjuvant;newcastle disease inactivated vaccine;preparation

S831；S852.65+9.5

A

1001-0084（2017）08-0039-04

2017-06-03

李洪艷（1978-），女，遼寧建平人，獸醫(yī)師，主要從事于疫苗生產。