不同蜜炙方法對(duì)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的影響

牛江濤 曹瑞 司昕蕾 邊甜甜 李越峰

摘要：目的 比較不同蜜炙方法對(duì)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的影響，為其蜜炙最佳工藝的建立提供依據(jù)。方法 采用傳統(tǒng)炒制、烘制、微波制的方法蜜炙紅芪；采用Agilent HC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈，13～25 min，40%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。結(jié)果 紅芪不同蜜炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量存在差異。紅芪烘制炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最高，分別為7.911 6、49.699 6 ?g/g；紅芪傳統(tǒng)炙品中二者含量最低，分別為4.776 7、37.291 0 ?g/g；紅芪生品和紅芪微波炙品中二者含量相當(dāng)，分別為5.080 2、42.798 9 ?g/g和3.983 9、42.314 5 ?g/g。結(jié)論 不同蜜炙方法對(duì)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量有一定影響，烘制炙法是紅芪蜜炙的最優(yōu)方法。

關(guān)鍵詞：紅芪；蜜炙；毛蕊異黃酮；芒柄花素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中圖分類(lèi)號(hào)：R283.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）09-

Effects of Different Honey Sunburn Methods on Calycosin and Formononetin in Hedysari Radix NIU Jiang-tao， CAO Rui， SI Xin-lei， BIAN Tian-tian， LI Yue-feng （1. Gansu University of Chinese Medicine， Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To compare the effects of different methods of honey sunburn on the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix； To provide the basis for the establishment of the optimum processing technology. Methods By frying （traditional method）， baking， and microwave methods put Hedysari Radix under honey sunburn. Agilent HC-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used； the mobile phase was acetonitrile-0.01% phosphoric acid solution， gradient elution （0–12 min， 30%–33% acetonitrile； 12–13 min， 31%–40% acetonitrile； 13–25 min， 40% acetonitrile） with velocity of 1.0 mL/min； detection wavelength was 248 nm； the column temperature was 30 ℃； sample volume was 10 ?L. Results There was statistical significance in the contents of calycosin and formononetin of different methods of honey sunburn for Hedysari Radix. Among them， the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by honey roast were the highest， 7.911 6 and 49.699 6 ?g/g， respectively； the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by traditional method were the lowest， 4.776 7 and 37.291 0 ?g/g， respectively； the contents of calycosin and formononetin in raw Hedysari Radix and Hedysari Radix by honey microwave method were the same， 5.080 2， 42.798 9 ?g/g， and 3.983 9， 42.314 5 ?g/g， respectively. Conclusion Different honey sunburn methods for the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix have certain effects， and honey roast method is the optimum method.

Key words： Hedysari Radix； honey sunburn； calycosin； formononetin

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81460611）；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（212186）；甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃（1010RJZA212、145RJZA076）；甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（2013-2）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研立項(xiàng)項(xiàng)目（GZK-2015-57）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-1-188）

通訊作者：李越峰，E-mail：lyfyxk@126.com

紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌功效。炙紅芪為紅芪的蜜炙炮制加工品，具有補(bǔ)中益氣功效，用于氣虛乏力、食少便溏[1]。毛蕊異黃酮和芒柄花素具有抗氧化、抗病毒、抗缺血、抗菌、降血脂和改善血象等作用[2-4]，是紅芪的主要活性成分。傳統(tǒng)炙紅芪炮制時(shí)火候不易控制，且翻炒不及時(shí)或不均勻都會(huì)導(dǎo)致受熱不均勻，容易炒焦或炒炙不夠，造成蜜炙紅芪品相不好，某些成分因溫度過(guò)高而分解，不利于蜜炙紅芪的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。而采用烘制和微波蜜炙紅芪，具有控溫容易、受熱均勻、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有利于提高炙紅芪質(zhì)量，促進(jìn)其標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本研究比較不同蜜炙工藝對(duì)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素2種異黃酮類(lèi)含量的影響，為建立最優(yōu)蜜炙炮制工藝提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），美的MM721AC8-PW微波爐（佛山市順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司），101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），AL104萬(wàn)分之一分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-5200 DTD超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），BT125D十萬(wàn)分之一分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），2N-04A粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司），HHS11S電熱恒溫水浴鍋（余姚市上通溫控儀器廠）。

試驗(yàn)所用紅芪藥材樣品采自甘肅省隴南市武都區(qū)米倉(cāng)山，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。毛蕊異黃酮對(duì)照品（批號(hào)150629，HPLC≥98%）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)150419，HPLC≥98%），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；甲醇（色譜純，批號(hào)20160305）、乙腈（色譜純，批號(hào)20151201），天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇（分析純，批號(hào)20151202），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸（色譜純，批號(hào)20150707），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水，蜂蜜為槐花蜜（桂林周氏順發(fā)食品有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 炙紅芪的制備

2.1.1 傳統(tǒng)炙品 根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，將紅芪藥材按要求切制為0.2～0.4 cm的厚片，取一定量紅芪飲片，加煉蜜悶潤(rùn)1 h，用文火炒至不粘手、表面紅棕色、略有光澤、具蜜香氣，鏟出放涼即可。每100 g紅芪用煉蜜25 g。

2.1.2 烘制炙品 取一定量紅芪飲片，加煉蜜悶潤(rùn)1 h，每100 g紅芪加煉蜜25 g。將悶潤(rùn)好的紅芪飲片置于磁碟中，厚度為3 cm，放入烘箱。烘制溫度為70 ℃，時(shí)間2.5 h，烘制完成后，取出放涼即可[5]。

2.1.3 微波炙品 取一定量紅芪飲片，加煉蜜，悶潤(rùn)1 h，每100 g紅芪加煉蜜25 g。將悶潤(rùn)好的紅芪飲片置于磁碟中，厚度2 cm，放入微波爐中。微波火力為低火（350 W，輸出功率50%），時(shí)間5 min，微波制完成后，取出放涼即可[6]。

2.2 供試品溶液制備

分別精確稱(chēng)取已過(guò)20目篩的紅芪不同炙品粉末各2.0 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，75 ℃水浴回流提取1 h，冰箱4 ℃放置冷卻，用定性濾紙過(guò)濾于100 mL蒸發(fā)皿中，45 ℃水浴濃縮，精密移至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度線，搖勻，再過(guò)0.45 ?m濾膜，搖勻，作為供試品溶液，備用[7]。

2.3 混合對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品0.97、3.99 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶中，作為貯備液A、B。分別精密吸取2種對(duì)照品貯備液2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件

采用Agilent HC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈；13～25 min，40%乙腈）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 ?L。在此色譜條件下，色譜圖分離度良好（見(jiàn)圖1）。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取一定量“2.3”項(xiàng)下貯備液A、B，制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液（其中毛蕊異黃酮濃度為0.242 5、0.485 0、0.727 5、0.970 0、1.455 0、1.940 0 ?g/mL，芒柄花素濃度為3.990、5.985、7.980、9.975、11.970、13.965 ?g/mL），進(jìn)樣10 ?L，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及其線性范圍，見(jiàn)表1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品貯備液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積RSD分別為0.16%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一紅芪供試品溶液，于4 ℃放置保存，分別于0、4、8、12、20、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定峰面積積分值并分別計(jì)算其RSD。結(jié)果毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積RSD分別為1.56%、0.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一份紅芪樣品（烘制，90 ℃，烘制2 h，厚度1 cm）粉末6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算各成分含量的RSD。結(jié)果毛蕊異黃酮的平均含量為4.44 ?g/g，RSD=2.80%；芒柄花素的平均含量為39.91 ?g/g，RSD=0.40%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的同一紅芪樣品（紅芪生品）6份，每份約1.0 g，精密加入等量的毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素平均回收率分別為96.31%和96.29%，RSD分別為0.89%和1.13%。

2.10 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取紅芪生品及不同蜜炙品，制備供試品溶液，測(cè)定毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

在供試品溶液的制備過(guò)程中，參照文獻(xiàn)[7-8]中的提取方法，對(duì)提取溶劑的選擇、料液比、提取方法、提取溫度、提取次數(shù)等做了比較和考察，最終優(yōu)選出供試品溶液的制備方法：甲醇為提取溶劑，料液比為1∶15（紅芪樣品粉末2.0 g，甲醇30 mL），回流提取，提取1次，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1 h。

色譜條件的選擇，考察了流動(dòng)相的種類(lèi)、比例及檢測(cè)波長(zhǎng)。以甲醇-水為流動(dòng)相洗脫時(shí)，色譜背景吸收較強(qiáng)，基線漂移較重，色譜峰數(shù)目較少，峰形不好。采用乙腈-水為流動(dòng)相洗脫時(shí)，背景吸收較弱，基線較好，色譜峰數(shù)目較多，但仍有部分峰沒(méi)有完全分離，峰形不好，存在拖尾現(xiàn)象。采用乙腈-0.01%磷酸水為流動(dòng)相洗脫時(shí)，色譜峰數(shù)目較多，峰形較好，能除去拖尾現(xiàn)象，達(dá)到極限分離的目的。故選用乙腈-0.01%磷酸水為流動(dòng)相。通過(guò)190～400 nm全波段掃描發(fā)現(xiàn)，在248 nm處有最大吸收且基線穩(wěn)定，毛蕊異黃酮和芒柄花素峰形最好，峰面積最大，因此確定248 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，紅芪傳統(tǒng)炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最低，這可能由于炒制過(guò)程中受熱不均勻，局部溫度過(guò)高，而使毛蕊異黃酮和芒柄花素部分分解。與紅芪生品相比，紅芪微波炙品中2種成分含量也有所降低，可能由于這2種異黃酮類(lèi)成分在微波輻射下部分分解。紅芪烘制炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最高，可能由于烘制過(guò)程中紅芪飲片受熱均勻且溫度較低（70 ℃），防止了毛蕊異黃酮和芒柄花素分解，且烘制過(guò)程使紅芪飲片變得酥脆，有利于有效成分的溶出?？梢?jiàn)，不同的蜜炙工藝對(duì)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量有一定的影響。本研究表明，烘制法蜜炙紅芪控溫容易、受熱均勻、操作簡(jiǎn)便，是紅芪蜜炙的最優(yōu)方法。

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（收稿日期：2017-01-14）

（修回日期：2017-02-21；編輯：陳靜）