不同產(chǎn)地車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量測(cè)定

易滿 封傳華 湯小林 徐蘭 陶曉璇 張浪 李剛

摘要：目的 建立車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷的含量測(cè)定方法。方法 采用紫外-可見分光光度法測(cè)定車前草中總苯乙醇苷含量。HPLC測(cè)定毛蕊花糖苷含量，色譜柱為ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（13∶87），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。結(jié)果 不同產(chǎn)地車前草中總苯乙醇苷含量范圍為1.03%～3.47%；毛蕊花糖苷在0.006 2～1.55 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為98.9%（RSD=1.6%），不同產(chǎn)地車前草中毛蕊花糖苷的含量范圍為0.18%～0.56%。結(jié)論 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、重復(fù)性較好，可用于不同產(chǎn)地車前草中苯乙醇苷類成分及毛蕊花糖苷的含量測(cè)定，為車前草的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：車前草；苯乙醇苷；毛蕊花糖苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）09-

Content Determination of Phenylethanoid Glycosides and Acteoside in Plantago Herba from Different Producing Areas YI Man1， FENG Chuan-hua1， TANG Xiao-lin2， XU Lan1， TAO Xiao-xuan1， ZHANG Lang1， LI Gang1 （1. No.94 Hospital of PLA， Nanchang 330002， China； 2. Children Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 330006， China）

Abstract： Objective To establish a method for determination of phenylethanoid glycoside and acteoside in Plantago Herba. Methods UV-visible spectrophotometric method was used for the determination of the content of phenylethanoid glycosides compounds in Plantago Herba. HPLC method was used for the determination of acteoside in Plantago Herba. Chromatographic column with C18 ODS2 （4.6 mm × 150 mm， 5 ?m） was used. Acetonitrile-0.1% formic acid （13：87） was as mobile phase； the flow rate was 1 mL/min； the detection wavelength was 332 nm； the column temperature was 30 ℃； the sample volume was 10 ?L. Results The contents of phenylethanoid glycoside in Plantago Herba from different producing areas were among 1.03%–3.47%. Acteoside with peak area over the 0.0062–1.55 mg range showed a good linear relationship； the sample recovery rate was 98.9%， and the RSD was 1.6%. The contents of acteoside in Plantago Herba from different producing areas was among 0.18%–0.56%. Conclusion The method is simple， stable and reproducible， which can be used for the determination of phenylethanoid glycoside and acteoside in Plantago Herba from different producing areas and provide experimental basis for quality control of Plantago Herba.

Key words： Plantago Herba； phenylethanoid glycosides； acteoside

車前草為車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，具有清熱利尿通淋、涼血、解毒等功效，主要用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒[1]。車前草中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜類等[2-3]。苯乙醇苷類是車前草中極具代表性的化學(xué)成分，具有抗菌、抗炎、

基金項(xiàng)目：2015年度軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題項(xiàng)目（15MS083）

通訊作者：封傳華，E-mail：fengch1986@126.com

抗氧化等藥理活性。毛蕊花糖苷是車前草中含量較高的苯乙醇苷類成分之一，具有降低尿酸、抗高血壓、增強(qiáng)免疫力等作用[4-5]。不同產(chǎn)地車前草中苯乙醇苷類及毛蕊花糖苷的含量存在較大的差異。本研究建立紫外-可見分光光度法測(cè)定車前草中苯乙醇苷類成分含量及HPLC測(cè)定車前草中毛蕊花糖苷含量的方法，為車前草的質(zhì)量評(píng)價(jià)及深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（包括CTO柱溫箱、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-15C泵、SPD-15C紫外檢測(cè)器），UV-765紫外可見分光光度計(jì)（上海軍科），AUW120D型分析天平（島津公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DFT-50手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

毛蕊花糖苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)150401，純度>98%）；不同產(chǎn)地車前草，均購自江西樟樹中藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)禇小蘭教授鑒定為車前Plantago asiatica L.的干燥全草；乙腈（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)201510011）；甲酸（分析純，西隴化工股份有限公司，1012051）；甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，20130320）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總苯乙醇苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為0.31 mg/mL的毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取車前草粉末（過2號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液及供試品溶液，于190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定各溶液的紫外吸收，結(jié)果顯示兩者的紫外吸收?qǐng)D譜相似，且在波長(zhǎng)為332 nm處均有最大吸收，故選擇332 nm作為車前草中總苯乙醇苷含量測(cè)定的波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，同時(shí)以相應(yīng)的溶劑作空白，于332 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=41.982X-0.221 3，r=0.999 5（n=3）。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度在0.003 1～0.155 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品含量測(cè)定 取車前草樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。每份樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算總苯乙醇苷含量。

2.2 毛蕊花糖苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 采用迪馬ODS2 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（15∶85），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。理論板數(shù)按毛蕊花糖苷計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜圖見圖1。

A

B

注：A.對(duì)照品；B.供試品（江西高安）；1.毛蕊花糖苷

圖1 車前草中毛蕊花糖苷HPLC圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10 ?L注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 000 000X-5832.2，r=0.999 1。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷在0.006 2～1.55 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量均為10 ?L，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.76%，表明精密度良好，符合含量測(cè)定的基本要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末（過2號(hào)篩），按供試品溶液制備方法平行制備6份溶液，分別精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.52%，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知毛蕊花糖苷含量的樣品粉末（過2號(hào)篩），精密稱取6份，分別加入毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法制備，分別精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.7 樣品含量測(cè)定 取車前草樣品，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取續(xù)濾液進(jìn)樣，根據(jù)已建立的色譜條件測(cè)定毛蕊花糖苷的峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算車前草中毛蕊花糖苷含量。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

取12個(gè)不同產(chǎn)地的車前草，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法和色譜條件分別測(cè)定總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量，結(jié)果見表2。

3 討論

在建立苯乙醇苷類含量測(cè)定方法過程中，本研究考察了溶劑種類、乙醇濃度、pH值、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑體積多個(gè)因素對(duì)提取效果的影響[6-8]，并選取影響提取效果較大的4個(gè)因素（乙醇濃度、pH值、提取時(shí)間和提取溶劑體積）進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定了車前草中苯乙醇苷類的提取方法，同時(shí)進(jìn)行了多批次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法比較穩(wěn)定，可用于車前草中苯乙醇苷類的提取。

毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在多個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，通過比較，最終選擇332 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下，雜峰對(duì)這2種成分含量測(cè)定的干擾最小[9-10]。同時(shí)，在考察毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取方法過程中，比較了甲醇、乙醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇6種不同的提取溶劑，對(duì)比了回流提取、超聲提取和靜置提取3種不同的提取方法，考察了不同提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)兩者含量測(cè)定的影響，最終確定采用50%乙醇回流提取2次、每次2 h的提取方法。

本研究共收集了12個(gè)不同產(chǎn)地的車前草樣品，研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷的含量存在較大差異，可能與產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候、田間管理、采收加工等有較大的相關(guān)性。中藥材內(nèi)在成分含量不同，對(duì)臨床藥效存在較大的影響，為獲得質(zhì)量穩(wěn)定、成分明確、藥效可靠的藥材，應(yīng)盡量選擇符合GAP的車前草。

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（收稿日期：2017-01-09）

（修回日期：2017-02-13；編輯：陳靜）