阮建+郭峰+李新國+史靈敏+田?，?張會+萬書波+彭振英

摘要：抗性篩選是農(nóng)桿菌介導的花生遺傳轉化過程中不可或缺的步驟，但是抗生素的使用對花生組培苗的生長與生根有著顯著影響。為了明確抗生素對花生組培苗生根的敏感質(zhì)量濃度，本試驗以花生栽培品種豐花1號組培苗為材料，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的頭孢霉素與卡那霉素，檢測花生組培苗的生根率及植株生長狀況并進行統(tǒng)計分析。結果表明：0～250 mg/L的頭孢霉素對花生組培苗生根及植株生長基本無影響?？敲顾貙ㄉM培苗生根影響較為顯著，0～10 mg/L卡那霉素對花生組培苗生根與生長基本無影響，10 mg/L卡那霉素條件下組培苗不長側根，15 mg/L卡那霉素顯著抑制根的伸長；切去不生根的組培苗底端后移入MS培養(yǎng)基又能重新生根，不切去底端的組培苗則不生根。經(jīng)過75 mg/L卡那霉素篩選的抗性組培苗的生根率可達31%。本研究可為花生遺傳轉化后期根的誘導提供一定的理論支持。

關鍵詞：頭孢霉素；卡那霉素；花生；組培苗；生根率；遺傳轉化

中圖分類號：S565.201 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0033-05

Abstract Resistance screening is an indispensable step in Agrobacterium mediated genetic transformation of peanut， but the use of antibiotics have significant influence on peanut seedling growth and rooting. In order to make clear the sensitive concentration of antibiotics on rooting of peanut seedlings， the peanut cultivation variety Fenghua 1 tissue culture seedlings were used as experimental materials， and the culture media with different concentrations of kanamycin or cefotaxime were used to detect the peanut seedling rooting rate and growth status. The results showed that 0～250 mg/L cefotaxime had little effect on peanut growth，while kanamycin had significant effect on peanut seedling rooting. 0～10 mg/L kanamycin has no obvious effect on peanut seedling rooting and growth， but under the condition of 10 mg/L kanamycin， the seedlings had no branch roots， whats more， 15 mg/L kanamycin significantly inhibited the elongation of roots. When the rootless plantlets were transfered into MS medium after cutting off the bottom of the seedlings， the roots grew out again， whereas the rootless plantlets did not grow roots if not cutting off the bottom. After screening with 75 mg/L kanamycin， the rooting rate of the kanamycin-resistant tissue culture plantlets could reach 31%. This study could provide certain theoretical supports for roots induction during the late stage of peanut genetic transformation.

Keywords Cefotaxime； Kanamycin； Peanut； Tissue culture seedling； Rooting rate； Genetic transformation

花生（Arachis hypogaea L.）是世界主要油料作物之一，種植地區(qū)主要分布在亞洲、非洲和美洲。中國是花生生產(chǎn)和消費第一大國?；ㄉ椭扛哌_50%，與其它油料作物相比，在含油量、單產(chǎn)、單位面積產(chǎn)油量等方面均具有一定優(yōu)勢[1]。

基因工程為花生遺傳改良提供了新的手段，可以通過外源基因導入及遺傳調(diào)控技術提高花生的抗逆性和改良花生的營養(yǎng)品質(zhì)[2-4]?；ㄉＳ玫霓D化方法主要有三類：一是基因槍法轉化胚性愈傷組織，通過體胚發(fā)生途徑分化再生；二是農(nóng)桿菌介導轉化胚小葉、子葉（節(jié)）或胚軸外植體，通過體胚發(fā)生或器官發(fā)生途徑分化再生；三是農(nóng)桿菌介導轉化莖尖外植體，直接發(fā)育成苗[5，6]。其中農(nóng)桿菌介導轉化法以其方法簡單、效率高、拷貝數(shù)少等優(yōu)點成為重要的、行之有效的方法之一[6]。

在花生陽性遺傳轉化植株篩選階段，污染是經(jīng)常發(fā)生的一種現(xiàn)象。污染包括真菌污染與細菌污染。真菌污染主要是孢子生長，污染后不易抑制應及時淘汰；細菌污染菌落吸附在培養(yǎng)基表面，可以通過抗生素進行抑制[7]。植物材料受農(nóng)桿菌浸染后，經(jīng)過一段時間的共培養(yǎng)，需要用抗生素及時有效地殺死或抑制細菌，以防止細菌危害植物組織并影響植株再生。常用抗生素為頭孢霉素與青霉素[8，9]，后期還會利用卡那霉素等抗生素進行陽性苗篩選，但是向培養(yǎng)基中加入抗生素勢必影響植物組織的正常生長與分化[10，11]。因此，研究抗生素對花生組培苗生根以及植株生長的影響，確定抗生素的適用范圍和使用量，對優(yōu)化花生遺傳轉化過程、提高遺傳轉化效率具有重要意義[12]。該試驗旨在研究不同濃度頭孢霉素和卡那霉素對花生組培苗生根及植株生長的影響，以期為提高花生組培苗的生根率提供有力依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生栽培品種豐花1號，本實驗室自存。頭孢霉素和卡那霉素均購自國藥。試驗于2016年在山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心組培室進行。

1.2 花生組培苗培養(yǎng)

挑選飽滿且大小均勻一致的豐花1號種子，用75%酒精溶液消毒2 min后用無菌水清洗兩遍，再用0.1%升汞溶液消毒8 min后用無菌水反復清洗5～6遍。將種子剝皮后放入1/2 MS培養(yǎng)基，置于25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)7天左右，切下頂芽作為外植體備用。

1.3 不同濃度抗生素處理

將切下的頂芽置于下列添加不同抗生素的MS基本培養(yǎng)基上。頭孢霉素共計7個濃度梯度，分別為25、50、75、100、150、200、250 mg/L，以不添加頭孢霉素的MS培養(yǎng)基為對照。卡那霉素共計6個濃度梯度，分別為5、10、15、20、25、30 mg/L，以不添加卡那霉素的MS培養(yǎng)基為對照。每種培養(yǎng)基插入的頂芽不少于30個。將培養(yǎng)材料置于25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，每日觀察并記錄植株生長與生根情況。

1.4 生根率與植株生長情況調(diào)查

從植株生根（0.1 cm）開始計算，到生根數(shù)目不再發(fā)生變化為止，計算每天的生根率，污染的植株不計算在內(nèi)。生根率（%）=生根植株數(shù)/供試植株總數(shù)×100。

觀察并分析不定根長度、粗細、生長狀態(tài)、顏色變化及側根萌發(fā)、植株生長情況等。

1.5 花生卡那抗性轉基因組培苗的篩選與生根

花生遺傳轉化與陽性株系的篩選具體參照文獻[13]進行。簡述如下：將攜帶卡那抗性基因的載體PRI101-AN通過農(nóng)桿菌介導的方法轉化到花生品種豐花1號的下胚軸中，誘導下胚軸產(chǎn)生大量叢生芽；將叢生芽轉移到含有75 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上進行陽性組培苗的篩選，經(jīng)過大約1個月的篩選獲得抗性組培苗。將抗性組培苗切去莖底端，保留頂端較為幼嫩且木質(zhì)化程度較低的部分，接種到不含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上誘導不定根并進行生根率統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 頭孢霉素對花生組培苗生根和生長的影響

在植株培養(yǎng)第4天起組培苗基部不定根開始萌發(fā)，此時起統(tǒng)計其生根率（表1）。通過對試驗組和對照組的比較分析，發(fā)現(xiàn)25～250 mg/L濃度的頭孢霉素對花生植株生根基本無影響（最終發(fā)根率都在95%以上）。試驗發(fā)現(xiàn)當不定根長到1 cm左右時開始長側根，通過對各個濃度梯度的植株生長情況比較發(fā)現(xiàn)，不同頭孢霉素濃度的培養(yǎng)基中組培苗生根的情況無明顯差異，后期植株的株高及測根的生長情況都比較類似。這說明在25～250 mg/L濃度范圍內(nèi)，頭孢霉素對花生組培苗生根及植株生長情況基本沒有影響。

2.2 卡那霉素對花生組培苗生根與生長的影響

從植株培養(yǎng)第4天起統(tǒng)計其生根率，結果（表2）表明，不同濃度的卡那霉素顯著影響花生組培苗生根和生長。5～15 mg/L濃度的卡那霉素對生根率的影響差異不顯著，但經(jīng)過后期不定根、植株生長的對比發(fā)現(xiàn)，卡那霉素濃度為5 mg/L時不定根比較粗短，側根少；濃度為10 mg/L時不定根雖長但無側根；濃度為15 mg/L時不定根均不到1 cm，以后便不再生長，呈現(xiàn)褐色。隨著卡那霉素濃度的升高生根率越來越低，當濃度為20 mg/L時，不定根長只有0.1 cm；而當濃度提高到25 mg/L時，則能夠完全抑制花生組培苗生根（表3、圖1）。可見較高濃度的卡那霉素對花生組培苗生根具有顯著的抑制作用。

就組培苗生長狀況來說，5～10 mg/L卡那霉素處理與對照植株相比無明顯差異，但15～20 mg/L卡那霉素處理的組培苗與對照相比則明顯生長緩慢。第15天時，對各處理植株進行比較，25～30 mg/L卡那霉素處理下，植株一直保持原有高度（表3）。

將25～30 mg/L卡那霉素濃度處理下不生根的組培苗分成兩部分，一部分直接轉入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分將莖底端切去以后轉入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。結果表明，切去莖底端的不生根組培苗又能重新生根且長勢良好，沒有切去底端的依然不能生根（圖2）。

2.3 花生卡那抗性組培苗生根情況分析

上述試驗結果表明，一定濃度的卡那霉素處理對花生組培苗生長具有顯著的抑制作用。文獻報道，高濃度的卡那霉素處理可使花生組培苗褪去綠色，植株變黃[14]，但是具有卡那抗性的轉基因植株卻能夠一直保持綠色和良好的生長狀態(tài)。這就是我們利用卡那霉素篩選抗性植株的依據(jù)。根據(jù)前期研究結果確定75 mg/L卡那霉素處理豐花1號轉基因組培苗可以獲得較為理想的篩選結果。為了驗證這些轉基因組培苗的生根情況，我們將其切去莖底端后接種到不含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上誘導不定根。經(jīng)過大約2～3周時間可見從莖底部長出不定根。據(jù)統(tǒng)計，生根率可達31%（圖3）。

3 討論與結論

花生是我國重要的經(jīng)濟作物。但是花生的組織培養(yǎng)與小麥、水稻、玉米等作物相比，差距很大，主要原因就是花生組培苗生根難、生根慢，而且生出的根多為畸形根，因而造成組培苗移栽成活率很低。對此人們想出很多辦法來解決這個問題，其中較為有效的一種就是嫁接法[15，16]，暫時緩解了花生組培苗生根難的問題。但是嫁接苗畢竟不同于實生苗，外植體嫁接過程中砧木會對接穗的適應性、抗病性、開花結果能力產(chǎn)生影響[17-19]。盡管花生接穗與砧木都是同一品種，但新基因的導入很可能使砧木對接穗產(chǎn)生影響，這嚴重影響成活率及其后期的轉基因苗的生理特性，因此要求花生的陽性轉化株系必須長出自己的不定根。

抗生素（antibiotic）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，為能干擾其它生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)?？敲顾厥且环N蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，通過與30S核糖體結合從而致使mRNA密碼誤讀?？敲顾乜剐缘馁|(zhì)粒經(jīng)常被作為選擇基因或標記基因用于分子克隆中。研究表明，卡那霉素對植物組培苗生長有明顯的抑制作用，大多植物材料對卡那霉素的敏感濃度為 5～100 mg/L，但是不同植物、不同材料、不同培養(yǎng)階段的耐受濃度各不相同。30 mg/L 卡那霉素能夠明顯抑制菊花莖段的分化，10 mg/L 能夠抑制生根[20]。楊樹葉片對卡那霉素的敏感濃度為 20～40 mg/L[21，22]。川芎的根、莖、葉對卡那霉素的耐受濃度為 20～40 mg/L[23]。黃瓜幼苗對卡那霉素的耐受濃度較高，可達200 mg/L[24]。endprint

在花生的遺傳轉化中，常以頭孢霉素作為光譜抗菌劑抑制細菌的生長，避免植株遭受污染，而以卡那霉素作為篩選劑進行陽性株系的篩選。王鳳歡等[14]研究花生胚小葉對卡那霉素的敏感性時發(fā)現(xiàn)，不同基因型對卡那霉素的敏感性不同，叢生芽生根的篩選濃度從10～20 mg/L不等。本研究表明，豐花1號組培苗對卡那霉素的敏感濃度為20 mg/L，高于此濃度則不生根。還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過卡那霉素處理的不生根組培苗，須將其底端切去后再轉入MS基本培養(yǎng)基中才能誘導產(chǎn)生不定根，而沒有切去底端的組培苗則很難生根，這有可能是因為組培苗莖底端積累了較多卡那霉素，抑制了花生組培苗生根。

在花生的遺產(chǎn)轉化中，卡那霉素的抗性篩選這個步驟至關重要?？敲顾貪舛忍停瑒t不能充分抑制或殺死未轉化的細胞，從而導致假陽性率過高；卡那霉素濃度過高，又抑制甚至殺死轉化細胞，導致不能得到足量的轉基因植株。因此需要對所選用的材料進行抗生素敏感性試驗。然而，植物葉片對卡那霉素的耐受性高于根系[14]，經(jīng)過高濃度卡那霉素篩選的抗性組培苗很難生根。本研究表明，經(jīng)過75 mg/L卡那霉素篩選的花生組培苗其生根率僅有31%，如何進一步提高其生根率仍需進行深入探索。另外發(fā)現(xiàn)，切去抗性苗底端可以顯著提高抗性組培苗生根率。本試驗結果可以為花生建立抗性篩選體系、提高抗性轉基因株系生根率提供技術支撐。

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