劉兆良+袁忠林+周長(zhǎng)健+羅蘭

摘要：以小麥為初篩靶標(biāo)生物，篩選到3株對(duì)其生長(zhǎng)具有抑制作用的海洋放線菌。采用平皿法以反枝莧、生菜和黃瓜為供試植物，測(cè)定3株海洋放線菌的除草活性。結(jié)果表明，菌株SLR2、GC3、AF2發(fā)酵液的上清液對(duì)反枝莧、生菜和黃瓜的種子幼根和幼芽具有較強(qiáng)的抑制作用，其中3種菌株發(fā)酵液的上清液對(duì)反枝莧幼根和幼芽的抑制率為100%，5倍稀釋液對(duì)反枝莧的抑制率均在50%以上；SLR2、GC3發(fā)酵液的上清液對(duì)生菜生長(zhǎng)的抑制率為95.1%～100%和80.9%～100%；SLR2發(fā)酵液的上清液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的抑制率為73.8%～77.4%。根據(jù)形態(tài)特征和16S rDNA 序列分析，將SLR2、GC3和AF2鑒定為原小單孢菌Promicromonospora umidemergens、淺多色鏈霉菌Streptomyces pluricolorescens和小鏈霉菌Streptomyces parvus。

關(guān)鍵詞：海洋放線菌；除草活性；篩選；鑒定

中圖分類號(hào)：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）08-0063-06

Abstract Three marine actinomyces with inhibitory effect on the growth of wheat were screened. The herbicidal activity of the three strains were determined using the plate method and with Amaranthus retroflexus， Lactuca sativa and Cucumis sativus as the tested plants. The results showed that there were obvious inhibitory effects of SLR2， GC3 and AF2 fermentation supernatant fractions on young root and bud growth of A. retroflexus， L. sativa and C. sativus. The inhibition rates of SLR2， GC3 and AF2 fermentation supernatants on young roots and buds of A. retroflexus were all 100%， and those of their five times supernatant diluents were more than 50%. The inhibition rates of SLR2 and GC3 fermentation supernatants on L. sativa were 95.1%～100% and 80.9%～100%， respectively， and those of SLR2 fermentation supernatants on C. sativus were 73.8%～77.4%. Based on the 16S rDNA sequence and physiological properties， the strain SLR2， GC3 and AF2 were identified as Promicromonospora umidemergens， Streptomyces pluricolorescens and Streptomyces parvus respectively.

Keywords Marine actinomycetes； Herbicidal activity； Screening； Identification

雜草嚴(yán)重危害農(nóng)作物的生長(zhǎng)和發(fā)育，每年造成的損失約占世界糧食總產(chǎn)量的10%[1，2]。化學(xué)除草劑具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也帶來(lái)了環(huán)境污染、雜草抗性等諸多問(wèn)題[3-5]。因此，開(kāi)發(fā)新型生物源除草劑已成為研制新農(nóng)藥的熱點(diǎn)。

生物源除草劑以資源豐富、毒性小、殘留少、環(huán)境兼容性好、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)于化學(xué)除草劑的特點(diǎn)，逐步引起人們的重視[6-8]。有關(guān)放線菌或其分泌物被開(kāi)發(fā)為商品作為除草劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的最早例子雙丙胺磷（double propylamine phosphorus）就是產(chǎn)綠色鏈霉菌（Streptomyces viridocbromogenes）的產(chǎn)物，已經(jīng)在日本開(kāi)始商品化生產(chǎn)并銷(xiāo)售，用來(lái)防治果園和非耕地一年或多年生雜草[1]。上海農(nóng)藥研究所發(fā)現(xiàn)的放線鏈霉菌產(chǎn)生的兩類環(huán)己酰亞胺物質(zhì)具有極強(qiáng)的除草活性，其發(fā)酵液的稀釋液處理野莧苗后的防效可達(dá)100%[9]。龍建友等[10]從陜西秦嶺山區(qū)采集的土壤中分離得到一株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）的放線菌，其發(fā)酵液和離子交換液對(duì)反枝莧種子的萌發(fā)、主根和主莖生長(zhǎng)抑制率分別為26.7%、80.6%、66.5%和42.9%、93.1%、86.2%，且經(jīng)HPLC得到的8個(gè)餾份中，餾份4的除草活性最強(qiáng)。魏松紅等[11]從遼寧省6個(gè)地區(qū)蔬菜田采集的29份土樣中分離得到138株放線菌，利用種子萌發(fā)法篩選出對(duì)馬唐種子萌發(fā)具有顯著抑制活性的SYM-2菌株，其校正抑制率達(dá)71.43%；發(fā)現(xiàn)其優(yōu)化后的發(fā)酵液的校正抑制率顯著高于其他各組。宗志友等[12]對(duì)放線菌612243菌株的除草活性成分進(jìn)行了分離與鑒定，獲得一個(gè)活性化合物612243-B，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)該化合物與已知的葡糖基殺粉蝶菌素（glucopiericidin A）相同。薛章榮等[13]對(duì)淺灰鏈霉菌CGMCC1370除草活性成分進(jìn)行了研究，種子萌發(fā)試驗(yàn)表明，在1 mg/L濃度下，該化合物可以抑制多種作物種子的萌發(fā)；盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在有效成分75 g/hm2劑量下，其對(duì)供試闊葉雜草的抑制率高達(dá)96.0%～100.0%；作物安全試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在2 000 g/hm2下其對(duì)花生和小麥依然安全。薛陜等[14]從實(shí)驗(yàn)室保存的海洋微生物中篩選出2株具有除草活性的海洋放線菌，其中1株還具有殺蟲(chóng)和抑菌活性。徐守建[15]對(duì)海洋微生物的農(nóng)用活性也進(jìn)行了初步研究，篩選出抑菌效果最好的一株海洋細(xì)菌并分析其活性物質(zhì)，該活性化合物除對(duì)茄交鏈孢菌等多種植物病原真菌具有更顯著的抑制作用外，還具有較強(qiáng)的除草活性。楊娟[16]從479株海洋微生物中篩選得到1株除草活性較強(qiáng)的Ha1菌株，其粗提物對(duì)馬唐和萊茵衣藻具有較強(qiáng)的活性，并對(duì)除草活性物質(zhì)進(jìn)行了分離和純化，研制出了菌株活體顆粒劑，發(fā)現(xiàn)添加助劑的顆粒劑對(duì)馬唐的抑制活性總是高于未添加助劑的，添加助劑的對(duì)馬唐的抑制率由90%下降到50%，而未添加助劑的抑制率由83%下降到23%。endprint

目前用于生物除草劑開(kāi)發(fā)的微生物主要來(lái)自陸源微生物，有關(guān)海洋微生物對(duì)雜草活性篩選的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但還不夠深入和系統(tǒng)，特別是海洋微生物代謝產(chǎn)物作為除草劑具有許多潛在優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室從青島海域采集樣品，分離篩選出具有殺蟲(chóng)活性的18株海洋放線菌[17]，在以小麥為靶標(biāo)生物進(jìn)行初篩的基礎(chǔ)上，對(duì)反枝莧、生菜和黃瓜進(jìn)行了生物活性測(cè)定，以進(jìn)一步篩選具有除草活性的海洋放線菌，為除草活性物質(zhì)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為18株海洋放線菌，詳見(jiàn)圖1，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室從青島附近海域的海水、海沙和海洋漂浮物等中分離獲得，現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

菌種的活化用改良的海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其配方為：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。菌株發(fā)酵用黃豆粉培養(yǎng)液，其配方為：葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉20 g，酵母膏2.5 g，新鮮的黃豆粉15 g，CaCO3 1.0 g，蒸餾水1 000 mL[17]。

1.3 供試植物種子

小麥（Triticum aestivum）為‘青麥6號(hào)，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院提供；黃瓜（Cucumis sativus）為‘魯黃瓜3號(hào)，生菜（Lactuca sativa）為抗熟‘綠湖黑核西生菜，均購(gòu)自城陽(yáng)種子市場(chǎng)；反枝莧（Amaranthus retroflexus）采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

1.4 菌株發(fā)酵及上清液的制備

參照劉志航等[17]的方法將活化的放線菌接種到改良的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，然后用直徑4 mm打孔器打取菌塊接種于裝有50 mL液體培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，3塊/瓶。28℃、160 r/min發(fā)酵5 d。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存，備用。

1.5 除草活性菌株的篩選及其生物活性測(cè)定

1.5.1 除草活性菌株的篩選 采用平皿法進(jìn)行除草活性測(cè)定[18]。將供試小麥種子保濕催芽，等露白后將種子放入海洋放線菌的發(fā)酵上清液中，10粒/皿，重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)露白種子放在清水中為對(duì)照，27℃恒溫培養(yǎng)，3 d后測(cè)定植株的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，計(jì)算幼根長(zhǎng)和幼芽長(zhǎng)抑制率。

幼根長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組幼根長(zhǎng)-處理組幼根長(zhǎng)）/對(duì)照組幼根長(zhǎng)×100

幼芽長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組幼芽長(zhǎng)-處理組幼芽長(zhǎng)）/對(duì)照組幼芽長(zhǎng)×100

1.5.2 除草活性菌株的生物活性測(cè)定 選用黃瓜、生菜和反枝莧種子，放入1.5.1中篩選出的除草活性菌株發(fā)酵上清液及5倍稀釋液中進(jìn)行測(cè)定。其它方法同上。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncans法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.6 除草活性菌株的鑒定

1.6.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)觀察 將篩選出的菌株SLR2、GC3和AF2接種到改良的海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲顏色、是否產(chǎn)生可溶色素等培養(yǎng)特征[20]。利用插片法對(duì)具有活性的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察。將滅菌蓋玻片以45°斜角插入待觀察菌培基中，28℃培養(yǎng)5～7 d后，取出蓋玻片，在顯微鏡下直接觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)[19，20]。

1.6.2 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 利用上海生工DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行SLR2、AF2和GC3菌株基因組DNA的提取，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為細(xì)菌16S rDNA序列分析所用引物：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將獲得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的分類地位[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草活性菌株的篩選

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行發(fā)酵液的稀釋，采用平皿法測(cè)定18株海洋放線菌發(fā)酵上清液對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響。圖 1和圖2結(jié)果表明，有16個(gè)海洋放線菌菌株的發(fā)酵上清液對(duì)小麥幼根的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，有12個(gè)菌株的發(fā)酵上清液對(duì)小麥幼芽的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，其中SLR2、AF2和GC3三個(gè)菌株的發(fā)酵上清液對(duì)小麥幼根和幼芽生長(zhǎng)抑制效果較強(qiáng)。

2.2 菌株的除草活性

由表1可知，SLR2、GC3和AF2菌株發(fā)酵上清液對(duì)黃瓜、生菜和反枝莧的生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用。其中，SLR2對(duì)反枝莧幼根和幼芽抑制率均達(dá)100%，對(duì)生菜幼根和幼芽抑制率在95%以上，對(duì)黃瓜幼根和幼芽的抑制率在70%以上。AF2對(duì)反枝莧幼根和幼芽抑制率均達(dá)100%，對(duì)黃瓜幼根和幼芽抑制率在75%以上。GC3對(duì)反枝莧幼根和幼芽抑制率均達(dá)100%，對(duì)生菜和黃瓜幼根和幼芽抑制率均在80%以上。發(fā)酵上清液稀釋5倍后對(duì)靶標(biāo)植物生長(zhǎng)的抑制率均明顯降低。SLR2發(fā)酵上清液對(duì)反枝莧和生菜幼根和幼芽的抑制效果見(jiàn)圖3。

2.3 菌株SLR2、GC3和AF2的分類鑒定

2.3.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)觀察 菌株SLR2在改良的海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基上菌落較小、微凸，周?chē)派錉睿跏季錇榘咨?，可產(chǎn)生黃色可溶性色素，后期變成黃色（圖4A）?；鶅?nèi)菌絲和氣生菌絲在生長(zhǎng)后期均斷裂，氣生菌絲少或生長(zhǎng)不好，有的在基絲或短柄上產(chǎn)生單個(gè)孢子（圖4B）。菌株SLR2的形態(tài)特征與文獻(xiàn)[22]中原小單孢菌屬（Promicromonospora）基本符合，初步確定SLR2為原小單孢菌。endprint

菌株AF2在改良的海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基上形成豐富的白色至灰色的氣生菌絲和淡黃色至深褐色基內(nèi)菌絲，菌落表面干燥，有褶皺，可產(chǎn)生黃色至深褐色的可溶性色素（圖5A）。產(chǎn)生柔曲的孢子絲并形成大量的橢圓形孢子（圖5B）。

菌株GC3在改良的海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基上形成白色至灰色氣生菌絲和黃色的基內(nèi)菌絲，并產(chǎn)生黃色可溶性色素（圖6A）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)有孢子絲及大量孢子，均為菌絲斷裂形成（圖6B）。菌株AF2和GC3的形態(tài)特征與文獻(xiàn)[22]中鏈霉菌屬（Streptomyces）基本一致，初步確定AF2和GC3為鏈霉菌。

2.3.2 16S rDNA 序列分析 菌株AF2、GC3和SLR2的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 368、1 339、1 346 bp，經(jīng)BLAST比對(duì)，菌株AF2與小鏈霉菌（Streptomyces parvus）（登錄號(hào)：KU317906）的相似性達(dá)100%。菌株GC3與淺多色鏈霉菌（Streptomyces pluricolorescens，登錄號(hào)：KU324442）的相似性達(dá)100%。菌株SLR2與原小單孢菌（Promicromonospora umidemergens，登錄號(hào)：JN180234）的相似性達(dá)99%以上。將菌株AF2、GC3和SLR2與參照菌株序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株AF2

與Streptomyces parvus在同一分支上，菌株SLR2與Promicromonospora umidemergens聚類到一起，菌株GC3與Streptomyces pluricolorescens相鄰（圖7）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株AF2、GC3和SLR2分別鑒定為Streptomyces parvus、Streptomyces pluricolorescens和Promicromonospora umidemergens。

3 討論與結(jié)論

目前已有很多關(guān)于除草活性放線菌篩選的研究報(bào)道[10-16]。本研究從18株海洋放線菌中篩選出對(duì)小麥、黃瓜、反枝莧和生菜生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制作用的3株放線菌，經(jīng)培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析，將AF2鑒定為小鏈霉菌S. parvus，GC3鑒定為淺多色鏈霉菌S. pluricolorescens，SLR2鑒定為原小單孢菌P. umidemergens。

鏈霉菌在自然界中分布廣泛，具有多種生物活性。劉偉等[23]對(duì)海洋小鏈霉菌DY2741中的抗菌物質(zhì)分離純化，初步判斷該組分為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），該成分為小鏈霉菌DY2741的主要抗菌物質(zhì)之一。田兆豐等[24]對(duì)小鏈霉菌Yn168的抗病毒成分分離研究，發(fā)現(xiàn)為小分子的蛋白質(zhì)。陳井生等[25]對(duì)分離于大豆田的放線菌進(jìn)行了抗南方根結(jié)線蟲(chóng)活性測(cè)定，結(jié)果表明H-2菌具有較高的選擇性殺線蟲(chóng)活性，初步鑒定H-2菌株為小鏈霉菌（S. parvus）。Rao等[26]還報(bào)道了S. parvus產(chǎn)生的脂肽是抗細(xì)菌的主要成分。孫建龍等[27]報(bào)道小鏈霉菌PH33對(duì)番茄潰瘍病菌有拮抗能力。淺多色鏈霉菌S. pluricolorescens也有抑菌活性的相關(guān)報(bào)道[28，29]。本研究從海洋分離的小鏈霉菌、淺多色鏈霉菌和原小單孢菌具有抑制植物生長(zhǎng)的作用，即具有除草活性。同類研究還未見(jiàn)報(bào)道，故而具有新穎性，值得深入研究。

海洋放線菌作為一個(gè)新興的領(lǐng)域，能夠產(chǎn)生多種新穎的化合物，其除草活性以及抗病機(jī)制的研發(fā)前景非?？捎^。雖然本文只是除草活性的初步篩選研究，但對(duì)以后田間除草效果、除草活性成分的分離與鑒定，對(duì)青島海域具有生物活性海洋放線菌的研究，以及利用海洋放線菌研制新型藥物奠定了一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。菌株SLR2、GC3和AF2生物活性物質(zhì)的分離及其他生物活性還有待進(jìn)一步探究。

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