王偉+文歡+汪頎浩+張大燕+彭成+高繼海

摘要：以廣元市旺蒼縣4個(gè)樣區(qū)136份杜仲樹(shù)皮為試材，采用HPLC法測(cè)定其綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量，活立木樹(shù)皮產(chǎn)量測(cè)算方法測(cè)算樹(shù)皮產(chǎn)量，研究杜仲樹(shù)皮產(chǎn)量及活性成分含量與樹(shù)齡、株高、胸徑及皮厚的相關(guān)性，為旺蒼縣杜仲優(yōu)良品種的選育提供有效參考。結(jié)果表明：4個(gè)樣區(qū)的杜仲樹(shù)皮綠原酸含量0.079%～1.208%，松脂醇二葡萄糖苷含量0.068%～5.251%，樹(shù)皮平均年產(chǎn)量0.03～2.56 kg。樹(shù)齡為6～28年杜仲樹(shù)皮，活性成分含量主要與樹(shù)齡、胸徑呈負(fù)相關(guān)，產(chǎn)量與樹(shù)齡、株高、胸徑、皮厚呈正相關(guān)。因此，可以將樹(shù)齡和胸徑2個(gè)指標(biāo)優(yōu)先納入旺蒼縣優(yōu)良杜仲的選育工作中。

關(guān)鍵詞：杜仲樹(shù)皮；活性成分；產(chǎn)量；生長(zhǎng)指標(biāo)；相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)：S567.1+90.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）08-0055-05

Abstract Using 136 bark samples from 4 areas of Wangcang County， Guangyuan City， the correlations of bark yield and active ingredient contents with age， plant height， diameter at breast height and bark thickness of Eucommia ulmoides were studied to provide references for breeding good varieties. The content of active ingredients in E. ulmoides barks was determined by HPLC method， and the bark yield was calculated in the alive condition. The results showed that the content of chlorogenic acid and pinoresinol diglucoside in E. ulmoides barks was 0.079%～1.208% and 0.068%～5.251% respectively， and the average annual bark yield was 0.03～2.56 kg. In the 6～28-year-old samples， the content of active ingredients was mainly negtively correlated with plant age and diameter at breast height， and the bark yield was positively correlated with the age， plant height， diameter at breast height and bark thickness. Therefore， tree age and diameter at breast height could be chosen as the prior indexes for variety breeding.

Keywords Eucommia ulmoides bark； Active ingredient； Yield； Growth and development characters； Correlation analysis

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）為杜仲科杜仲屬植物，分布于我國(guó)秦嶺、黃河以南、五嶺以北、黃海以西及云南高原以東區(qū)域，其間基本上是長(zhǎng)江中下游流域[1]。其樹(shù)皮別名絲綿皮、玉絲皮，是我國(guó)特色的名貴中藥材[2]。杜仲在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被作為上品藥物，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗骨質(zhì)疏松癥、抗腫瘤、護(hù)肝、降血糖、抗衰老等功效[3]。

杜仲在我國(guó)的應(yīng)用歷史長(zhǎng)達(dá)兩千多年[4]，但其資源已遭到嚴(yán)重破壞，杜仲大樹(shù)幾乎被毀殆盡[5]，目前已被國(guó)家列入重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象。國(guó)外于19世紀(jì)末開(kāi)始引進(jìn)杜仲，20世紀(jì)對(duì)其應(yīng)用研究開(kāi)始快速發(fā)展[6]。我國(guó)學(xué)者于20世紀(jì)80年代初，針對(duì)杜仲產(chǎn)量、抗逆性等方面，已對(duì)杜仲資源的選育工作進(jìn)行了研究[7]。但由于我國(guó)杜仲分布廣泛，對(duì)其選育工作尚未系統(tǒng)開(kāi)展[8]，且尚未將功效活性成分納入其資源優(yōu)選指標(biāo)。因此，本研究測(cè)定了杜仲樹(shù)皮的活性成分及產(chǎn)量，并分析其與樹(shù)齡、株高、胸徑、皮厚的關(guān)系，以期更好地了解杜仲樹(shù)皮產(chǎn)量及活性成分含量的影響因素，并將活性成分作為優(yōu)選指標(biāo)應(yīng)用到杜仲選育工作中，為當(dāng)?shù)囟胖俚牟墒占斑x育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）、KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（美國(guó)安捷倫科技有限公司）、SW-02A多功能粉碎機(jī)（廣州泰豐）、UPT-II-10T優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）、CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius）。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自成都思為科學(xué)儀器有限公司。磷酸為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。綠原酸對(duì)照品（CAS：327-97-9，純度為98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司， 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16060722，純度為97.5%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 材料

杜仲樹(shù)皮采自廣元市旺蒼縣億明生物科技有限公司杜仲種植基地，分別從同一個(gè)產(chǎn)區(qū)4個(gè)不同海拔樣區(qū)（海拔572.0 m，106°18′7″E，32°13′43″N；海拔534.4m，106°18′16″E，32°13′42″N；海拔552.1 m，106°18′16″E，32°13′42″N；海拔520.3 m，106°17′1″E，32°13′51″N）采集，林下植被均為草本植物，土壤為紅砂土，地貌為山地緩坡。每個(gè)樣區(qū)隨機(jī)采集20～35株杜仲的樹(shù)皮，總計(jì)136份樣品，樹(shù)齡在6～28年之間，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)鑄云教授鑒定，為杜仲科杜仲屬植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的樹(shù)皮，編號(hào)后常溫干燥保存。部分樣品指標(biāo)見(jiàn)表1。endprint

1.3 綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件 參照劉慧等[8]的方法并改進(jìn)：色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%磷酸水溶液。LC結(jié)束時(shí)間60.01 min；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；總流速為1.00 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫30℃。采用梯度洗脫：0.01～7.00 min，93%B；7.00～35.00 min，86%B；35.01～45.00 min，85% B；45.01～60.00 min，93%B。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品2.62、1.83 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成0.524 mg/mL的綠原酸以及0.366 mg/mL的松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品溶液的制備 取適量樣品置于粉碎機(jī)中粉碎至絮狀，精密稱取1 g置于100 mL錐形瓶中[8]，同時(shí)精密量取25 mL 60%的甲醇溶液置于具塞錐形瓶中。超聲提取40 min后，稱重，用60%的甲醇溶液補(bǔ)足減少的質(zhì)量。振蕩后用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，取1.6 mL左右濾液至進(jìn)樣瓶中得到供試品溶液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取1.3.2中對(duì)照品溶液0.1、0.5、0.6、0.8、1.0、2.0 mL至5 mL容量瓶中，甲醇定容。將對(duì)照品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜注入進(jìn)樣瓶，按照1.3.1的方法進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.3.5 樣品測(cè)定 將樣品溶液按照1.3.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定樣品溶液中的綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的峰面積，將樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較，利用兩者的回歸方程計(jì)算相應(yīng)成分的質(zhì)量濃度。

1.4 產(chǎn)量計(jì)算方法

樹(shù)皮產(chǎn)量計(jì)算參照葉萌等[9]的方法進(jìn)行。剝下適量杜仲樹(shù)皮后，計(jì)算鮮樹(shù)皮物理密度（樹(shù)皮單位材積的重量），并計(jì)算待測(cè)植株的樹(shù)皮材積，二者乘積即杜仲樹(shù)皮產(chǎn)量。

杜仲樹(shù)皮的長(zhǎng)、寬、樹(shù)干直徑均由皮尺測(cè)量，鮮重采用EL-2JK高精度電子天平稱量，厚度采用YG142-2/3型手提式測(cè)厚儀測(cè)定，高度采用克里斯屯測(cè)高器測(cè)量（廣元億明生物科技有限公司測(cè)得）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 18軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖

在1.3.1色譜條件下，松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸及其它峰分離較好，見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品和樣品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖省略），計(jì)算得到綠原酸的回歸方程為 y=7000000x-17307，r=0.9999，線性范圍為0.01048～0.2096 mg·mL-1；松脂醇二葡萄糖苷的回歸方程為y=2000000x-14883，r=0.9992，線性范圍為0.00732～0.1464 mg·mL-1。說(shuō)明二者線性關(guān)系均較好。

2.3 樣品中綠原酸及松脂醇二葡萄糖苷的含量

部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。4個(gè)樣區(qū)的杜仲樹(shù)皮綠原酸含量為0.079%～1.208%，松脂醇二葡萄糖苷含量為0.068%～5.251%，后者波動(dòng)較大，總體趨勢(shì)上兩者的含量都隨著樹(shù)齡的增大而降低。

2.4 杜仲樹(shù)皮產(chǎn)量計(jì)算結(jié)果

4個(gè)樣區(qū)的杜仲樹(shù)皮年產(chǎn)量為0.03～2.56 kg，平均為1.05 kg，該批次總體趨勢(shì)上隨樹(shù)齡、株高、皮厚、胸徑的增大而增大。部分樣品的產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 杜仲樹(shù)皮產(chǎn)量及活性成分含量與樹(shù)齡、皮厚、株高、胸徑的相關(guān)性分析

由表4可知，杜仲樹(shù)皮綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量與樹(shù)齡、胸徑均分別呈極顯著、顯著負(fù)相關(guān)，與皮厚、株高無(wú)顯著相關(guān)性。年產(chǎn)量與樹(shù)齡、皮厚、株高、胸徑均呈極顯著正相關(guān)，其中，年產(chǎn)量與株高的相關(guān)系數(shù)最大。

3 討論與結(jié)論

綠原酸與松脂醇二葡萄糖苷為杜仲重要的功效活性成分之一，研究表明，綠原酸具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、保肝等作用[11]，而松脂醇二葡萄糖苷具有降血壓的功效。因此，綠原酸與松脂醇二葡萄糖苷含量與生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性研究是選育工作關(guān)鍵之處。分析結(jié)果表明，總體趨勢(shì)上，杜仲樹(shù)齡在6～28年的時(shí)候綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量隨樹(shù)齡、胸徑的增大而降低。

馬金花等[12]關(guān)于杜仲葉的研究結(jié)果顯示：光合作用產(chǎn)生的淀粉降解后成為苯丙烷類代謝途徑的前體物質(zhì)，而綠原酸是該代謝過(guò)程中的一種苯丙素類化合物，隨著樹(shù)齡增大，樹(shù)葉光合作用減弱，樹(shù)葉中的綠原酸含量降低。由于樹(shù)皮不進(jìn)行光合作用，樹(shù)葉中的綠原酸含量遠(yuǎn)高于樹(shù)皮[13]，因此可以推測(cè)杜仲樹(shù)皮中的綠原酸含量與樹(shù)葉中的含量可能有一定聯(lián)系，即隨著樹(shù)葉中的綠原酸不斷累積，一部分向樹(shù)皮轉(zhuǎn)移；當(dāng)樹(shù)齡增大時(shí)，樹(shù)葉的光合作用減弱，綠原酸含量降低，從而導(dǎo)致樹(shù)皮中的綠原酸含量降低，由于樹(shù)干及樹(shù)皮均不進(jìn)行光合作用，所以皮厚、株高對(duì)綠原酸含量的影響不顯著。因此，杜仲樹(shù)皮中綠原酸的含量主要與樹(shù)齡有關(guān)。松脂醇二葡萄糖苷屬于雙環(huán)氧類木脂素，是杜仲藥材質(zhì)控的重要指標(biāo)[14]。植物體內(nèi)木脂素類化合物是由苯丙烷類化合物合成轉(zhuǎn)化所得[15]。綠原酸是苯丙烷類次級(jí)代謝過(guò)程中關(guān)鍵的中間化合物之一，其含量降低有可能導(dǎo)致木脂素合成減少，最終導(dǎo)致松脂醇二葡萄糖苷化合物的生物合成減少。此外，木質(zhì)素也是由苯丙烷類代謝途徑的產(chǎn)物合成[16]，隨著樹(shù)齡、胸徑的增加，更多苯丙烷類代謝途徑的產(chǎn)物用于合成木質(zhì)素，由于杜仲自身代謝有限，可能導(dǎo)致松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸合成減少。endprint

杜仲樹(shù)皮的平均年產(chǎn)量即生物累積量，是衡量樹(shù)種優(yōu)劣和藥材產(chǎn)量的重要指標(biāo)，直接關(guān)系藥農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。本研究結(jié)果表明，杜仲樹(shù)皮的年產(chǎn)量與樹(shù)齡、皮厚、株高、胸徑均呈極顯著相關(guān)，其中與株高的相關(guān)性最大（r=0.898），其次是胸徑。因此在這批樣品中，株高對(duì)樹(shù)皮產(chǎn)量的影響最大。

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