馬曉凡+李林

摘要：在山東日照地區(qū)同時采集大豆[Glycine max （L.） Merr]、菜豆（Phaseolus vulgaris L.）根瘤，分離純化，保藏根瘤菌共54株，通過提取DNA，PCR recA基因，通過Blast比對及recA基因的系統(tǒng)進化分析，研究日照地區(qū)大豆與菜豆根瘤菌遺傳多樣性。結果表明，在90%以上的相似水平上，日照大豆中的根瘤菌分布于根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬3大屬，圓明慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌4個種，3個未定種。日照菜豆中的根瘤菌全部分布于根瘤菌屬，菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、赤小豆根瘤菌3個種，2個未定種，其中一個進化距離較遠，可能為潛在新種。證明了日照大豆、菜豆根瘤菌豐富的遺傳多樣性，且日照大豆根瘤菌多樣性大于日照菜豆。

關鍵詞：大豆[Glycine max （L.） Merr]；菜豆（Phaseolus vulgaris L.）；根瘤菌；遺傳多樣性

中圖分類號：S565.1；S643.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2938-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.035

Abstract： The soybean[Glycine max （L.） Merr] and kidney bean（Phaseolus vulgaris L.） rhizobia were collected simultaneously，and a total of 54 rhizobia were separated， purified and then preserved. After the extraction of total DNA，the recA gene was amplified using PCR and the obtained sequences were blasted with those selected from genbank，and phylogenetic analysis was then done. The genetic diversity of soybean and kidney bean rhizobia from Rizhao was studied. At a similarity of more than 90%， soybean rhizobia from Rizhao were identified as Bradyrhizobium yuanmingense，Bradyrhizobium japonicum，Rhizobium phaseoli， Rhizobium leguminosarum，and other three undetermined species. They were affiliated with Rhizobium，Bradyrhizobium and Burkholderia. The kidney bean rhizobia from Rizhao were identified as Rhizobium phaseoli，Rhizobium leguminosarum，Adzuki bean rhizobia，and other two undetermined species， among which one species showing a remote evolutionary distance from the others was probably a potential new species. The results proved the high genetic diversity of soybean and kidney rhizobia from Rizhao and revealed that the soybean rhizobia were more diverse than the kidney bean rhizobia.

Key words： soybean[Glycine max （L.） Merr]；kidney bean（Phaseolus vulgaris L.）；rhizobia；genetic diversity

氮是植物所需要的大量元素之一。缺氮會導致植物生長緩慢，葉面積減少，分蘗減少，株高變矮，葉片發(fā)黃，甚至不能開花結果[1]。但當植物有充足的氮素營養(yǎng)時，葉綠素的形成會加快，葉色變深，葉面積增大，提高光合作用，促進植物生長和果實發(fā)育，因此氮對植物有至關重要的作用。農業(yè)生產需要大量的氮肥，但生產化學氮肥需要消耗大量化石燃料，產生大量污染物及溫室氣體的排放，造成環(huán)境污染，同時，也會產生巨大的經濟壓力。雖然氮氣占空氣體積的80%，但植物不能直接利用。自然界中有少部分固氮微生物可以將氮氣固定轉化成可被植物吸收利用的氨，即生物固氮[2]。根據固氮方式的不同，生物固氮分為自生固氮、共生固氮以及介于兩者之間的聯(lián)合固氮。每年全球生物固氮量達1.75×108 t，是工業(yè)氮肥產量的4.37倍[3]，其中2/3以上為共生固氮[4]。

生物固氮中效率最高的體系是根瘤菌和豆科作物間的共生固氮體系，其可為豆科作物提供一半以上的氮素營養(yǎng)，全球每年固定的氮素達到7千萬t。除了供給宿主植物氮素，也能在土壤中留下大量的氮素，后續(xù)供給其他植物和微生物利用，對養(yǎng)地改土有很好的作用[5]，在農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和氮缺乏地區(qū)的生態(tài)環(huán)境修復中有重要作用[6]。此外，全世界大約1/5的蛋白食品是由豆科植物提供的[3]，因而研究豆科植物-根瘤菌固氮體系，探索新的根瘤菌種類與資源，保藏并科學利用根瘤菌基因資源，篩選相應的高效菌株并直接應用于農業(yè)生產與生態(tài)環(huán)境修復有重要意義。

根瘤菌作為高效共生固氮體系的主要成員，是自然界和農業(yè)系統(tǒng)中最有價值的微生物資源之一。因此，在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中開展的大豆根瘤菌資源多樣性研究，對揭示大豆根瘤菌種群及其多樣性演變過程、高效根瘤菌株的選育和應用具有重要意義。本研究分析了日照地區(qū)大豆與菜豆根瘤菌遺傳多樣性，探索新的根瘤菌資源，為后續(xù)的根瘤菌篩選和育種工作提供參考。endprint

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

培養(yǎng)基：根瘤菌培養(yǎng)用YMA培養(yǎng)基（pH=7.0）。成分為甘露醇10.0 g、酵母粉3.0 g、KH2PO4 0.25 g、KH2PO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、瓊脂粉15～20 g、去離子水1 L。

PCR試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑購于上海生工生物工程技術服務有限公司；PCR擴增儀、高速離心機Eppendorf 5417R（美國Eppendorf公司）；DNA試劑盒購于上海生工生物工程技術服務有限公司；擴增引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；電泳儀；UV掃膠儀；生化培養(yǎng)箱；超凈臺；元素分析儀；原子吸收分光光度計；超低溫冰箱等。

1.2 根瘤的采集

從多年種植大豆的同一塊土地中，挖掘時用鐵鏟小心挖開大豆根部土壤，露出根系，每個點挑選個大飽滿、呈淺粉色、新鮮的根瘤（帶點根，以保證根瘤的完整），裝入變色硅膠干燥管中蓋嚴，做好標記，帶回實驗室進行分離。

日照菜豆的采樣方式與日照大豆相同。

1.3 根瘤的分離、純化、保存

用自來水將根瘤上泥土清洗干凈后，95%的乙醇浸泡30 s以消除表面張力，倒出乙醇，再用0.2%的HgCl2浸泡2～5 min（視根瘤大小而定）進行表面消毒，最后用無菌水沖洗5～6次。將表面消毒過的根瘤分裝到無菌的1.5 mL離心管中（每個1枚），用尖部燒鈍冷卻的黃槍頭將根瘤搗碎，用移液槍將汁液吸取轉到YMA平板上劃線，做好標注后，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。如無單菌落出現(xiàn)，要重新在YMA平板上劃線，直至長出單菌落。革蘭氏染色鏡檢合格的單菌落再次在YMA平板上劃線，擴大培養(yǎng)，生長2～3 d后，收集菌體，一部分保藏于裝有20%甘油的管中，一式兩份，做好標記，裝入冷凍盒，登記后于-80 ℃冰箱進行菌種保藏，另挑取一部分菌體于1.5 mL離心管中，做好標記后，裝入冷凍盒，置于-20 ℃冰柜，用于DNA提取。

1.4 根瘤菌總DNA的提取，recA基因的擴增

根瘤菌總DNA提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒，操作步驟依照說明書進行。提取的DNA做好標記，放入冷凍盒，-20 ℃保存。用于根瘤菌recA基因的擴增引物：正向引物recA 41F（5′-TTCGGC AAGGGMTCGRTSATG-3′）、反向引物recA 640R （5′-ACATSACRCCGATCTTCATGC-3′）。recA基因PCR 擴增體系（50 μL）：2× PCR Mix 25 μL，recA 41F（10 μmol/L）1 μL，recA 640R（10 μmol/L）1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保持。

1.5 測序及分析

擴增的recA基因片段約為600 bp，取4 μL PCR產物，100 V，1.0%瓊脂糖凝膠（含1 μg/mL熒光染料Genecolor）電泳40 min，檢測PCR產物片段的長度和亮度，驗證合格的送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序后的結果進行Blast比對，找出所屬的物種及相似度。采用MEGA 5.0軟件中的Clustal W功能，序列比對后，采用Maximum composite likelihood模型計算序列距離矩陣，并用鄰接法（NJ）構建進化樹進行聚類分析，自展值（bootstrap）為1 000。根據序列對、進化樹及序列矩陣的相似性，將recA基因序列相似性為100%的定為同一基因型。

2 結果與分析

2.1 采樣信息

于2015年10月對日照大豆和日照菜豆進行取樣，分離根瘤數(shù)分別為56、53個，純化菌株數(shù)分別為29、25株，PCR產物分別為12、13個。

2.2 電泳檢測結果

選取的recA基因片段為500～800 bp，驗證合格進行測序，其中25株可能屬于根瘤菌。圖1為recA基因片段電泳結果。

2.3 Blast比對結果

2.3.1 日照大豆比對結果 日照大豆中的根瘤菌分布于根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬三大屬。其中，根瘤菌屬中，有菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌兩個種；慢生根瘤菌屬種中，有圓明慢生根瘤菌種、大豆慢生根瘤菌種，還有未確定種的兩株；另外一種屬于伯克霍爾德菌屬，未確定種（表1）。

2.3.2 日照菜豆比對結果 日照菜豆的根瘤菌都分布于根瘤菌屬，其中已確定的有3個種，分別為菜豆根瘤菌種、豌豆根瘤菌種、赤小豆根瘤菌種，有兩個未定種（表2）。

2.4 recA基因型系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4.1 日照大豆recA基因系統(tǒng)進化樹分析 根據日照大豆recA基因系統(tǒng)進化樹（圖2），結果與Blast比對結果基本一致。RD001與RD004不屬于根瘤菌，所以與其余菌株進化關系較遠。其余菌株里，分為兩大進化分支。其中一支包括RD003、RD007、RD008、RD009、RD011、RD010，對比Blast比對結果，即全部屬于慢生根瘤菌屬，該分支又分為3小支，RD003、RZ007、RZ008、RZ009屬于同一小支，相似性很大，很可能屬于同一種；另一支包括RD002、RD005、RD006，其中RD005、RD006進化關系較近，對比Blast比對結果，屬于根瘤菌屬；RD002屬于單獨另一小分支，對比Blast比對結果，屬于伯克霍爾德菌屬，可能與根瘤菌屬關系很近。

2.4.2 日照大豆recA基因系統(tǒng)進化樹分析 根據日照菜豆recA基因系統(tǒng)進化樹（圖3），結果與Blast比對結果基本一致。RC001、RC003、RC005、RC006、RC010、RC011、RC014屬于同一分支，根據Blast比對，屬于根瘤菌屬菜豆根瘤菌；RC012、RC013進化水平基本一致，很可能屬于同一種；RC002、RC004、RC007、RC009屬于同一種，即根瘤菌屬豌豆根瘤菌；RC008單獨在一分支，進化距離較遠，很可能為一個潛在新種。endprint

3 小結與討論

根瘤菌是革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于土壤中，雖然它們的起源相同[7]，但由于受環(huán)境脅迫以及宿主植物選擇的影響，進化方向各異，經過長期的演變形成表型與遺傳型的高度多樣性。表型多樣性是細菌基因差異的體現(xiàn)，雖然在一定程度上通過表型分析能夠反映根瘤菌間的遺傳差異，但始終很難全面地反映全部的基因特征。而遺傳多樣性研究包括兩個層面，一是基因組水平上的，二是對特殊基因酶切圖譜及序列測定分析。

本研究采用Blast對比及recA基因的系統(tǒng)進化分析對來自中國日照地區(qū)的54株大豆、菜豆根瘤菌的遺傳多樣性進行比對研究。將54株根瘤菌在較低相似性值水平上分為3個群，分屬于根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬。其中大豆菌株，分布于3個屬，4個種，3個未定種。菜豆菌株全部分布于根瘤菌屬，下分3個種及2個未定種。由此可以看出，日照大豆根瘤菌的遺傳多樣性遠遠大于日照菜豆。

在細菌分類和進化研究中，16S rDNA序列測定與分析已成為所有分類單元中必需的分析項目和首選的分子標記，在數(shù)據庫中積累了大量可供比對和新種鑒定的序列資料。由于16S rRNA基因序列具有高度的保守性，其在根瘤菌研究中不足以區(qū)分進化關系比較近的種。16S rRNA基因在細菌種或屬間存在橫向轉移及重組也會造成某些菌株鑒定的不確定性[8]。同一株菌株中可能存在16S rRNA基因的不同拷貝，序列不完全一樣。因此，在根瘤菌種群的劃分、種內遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究中持家基因的分析做補充是很有必要的。隨著基因測序技術的發(fā)展，多基因序列的測定和分析已成為新的發(fā)展趨勢。越來越多全基因組序列測定的完成將會使基于基因組水平的系統(tǒng)發(fā)育的建立成為可能。

參考文獻：

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[3] 林稚蘭，黃秀梨.現(xiàn)代微生物學與實驗技術[M].北京：科學出版社，2000.

[4] 陳文新，李阜棣，閆章才.我國土壤微生物學和生物固氮研究的回顧與展望[J].世界科技研究與發(fā)展，2002，24（4）：6-12.

[5] 陳文新，汪恩濤，陳文峰.根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環(huán)境的關系[J].中國農業(yè)科學，2004，37（1）：81-86.

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[8] WERNEGREEN J J，RILEY M A. Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and housekeeping loci：A case for the geneticcoherence of rhizobial lineages[J].Molecular Biology and Evolution，1999，16（1）：98-113.endprint