王鑫 張毅 胡牧 王若天 劉磊 錢坤 李元博 支修益

肺癌是我國(guó)以及世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一,其中小細(xì)胞肺癌占13%-15%,預(yù)后較差,侵襲性強(qiáng),與吸煙狀態(tài)相關(guān)[1,2].小細(xì)胞肺癌主要分為局限期和廣泛期[3].如果能在疾病較早期對(duì)小細(xì)胞肺癌預(yù)后有所判斷,制定合理的治療方案積極進(jìn)行救治,達(dá)到改善生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生存的目的.有研究顯示,某些免疫表型標(biāo)記物,如神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor-1, TTF-1)、CD56、P40等在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,并應(yīng)用于臨床病理診斷.TTF-1是一種分子量為40 kDa的核蛋白,是NKx2轉(zhuǎn)錄基因家族的成員之一最常見(jiàn)其在甲狀腺和肺組織中表達(dá),并在甲狀腺和肺組織癌變過(guò)程中起著重要的作用,調(diào)控多種基因的表達(dá)[4].TTF-1為II型肺泡細(xì)胞和Clara細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,在肺小細(xì)胞癌與肺泡細(xì)胞癌中表達(dá)率高,目前臨床中常用于非小細(xì)胞肺癌病理分型診斷和鑒別診斷的免疫組化標(biāo)志物有:Napsin A和TTF-1常用腺癌的診斷,CK5/6、p63以及p40常用于鱗狀細(xì)胞癌的診斷.而這些指標(biāo)在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)如何,特別是小細(xì)胞肺癌的預(yù)后中研究較少,部分研究的結(jié)果也并不一致.本研究通過(guò)198例小細(xì)胞肺癌患者及其癌組織標(biāo)本的回顧性分析,探討TTF-1、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子CD56、P40蛋白以及臨床特征在小細(xì)胞肺癌預(yù)后中價(jià)值,以期為其他研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及資料搜集 收集2009年1月1日-2014年1月1日來(lái)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院胸外科初次就診并確診的小細(xì)胞肺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本及臨床病理資料.患者納入標(biāo)準(zhǔn):①病例經(jīng)肺穿刺、纖維支氣管鏡或手術(shù)病理標(biāo)本確診為小細(xì)胞肺癌;②石蠟包埋病例肺癌組織標(biāo)本保存完好,有完整的臨床病歷資料;③年齡>18周歲;④接受以鉑類為基礎(chǔ)的一線藥物聯(lián)合化療,治療方案包括依托泊苷聯(lián)合卡鉑 /順鉑(EP/CE),托泊替康聯(lián)合卡鉑/順鉑(IP/IC);⑤患者有明確的隨訪資料,包括電話、地址等,依從性好.

收集患者的臨床資料,包括采集病例相關(guān)的臨床病理資料,包括年齡、性別、吸煙史、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)評(píng)分、病理類型、是否合并上腔靜脈綜合征及臨床分期.分別根據(jù)第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)國(guó)際腫瘤分期進(jìn)行腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis, TNM)分期以及美國(guó)退伍軍人肺癌研究組(Veterans Administration Lung Study Group,VALG)制定的分期進(jìn)行局限期和廣泛期劃分;根據(jù)ECOG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行體力狀態(tài)評(píng)分.總生存時(shí)間(overall survival, OS)定義為患者開(kāi)始治療至患者死亡或末次隨診時(shí)間.無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間(progression free survival , PFS)為從第一次給藥至疾病進(jìn)展或死亡時(shí)間.末次隨訪時(shí)間為2017年4月.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及試劑 采用免疫組化EnVision兩步法,進(jìn)行TTF-1、P40、CD56抗體檢測(cè).按照4 μm左右厚度把癌組織切片,經(jīng)過(guò)二甲苯中脫蠟、梯度酒精水化、PBS清洗、抗原修復(fù)后,滴加I抗,孵育,滴加增強(qiáng)復(fù)合物,滴加II抗,置于濕盒內(nèi),37oC孵育30 min,PBS清洗后,DAB試劑盒顯色,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,鹽酸酒精分化,酒精脫水,二甲苯透明30 min,中性樹膠1滴,蓋波片封片.免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品.

1.3 結(jié)果判定 分別由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生閱片審核.TTF-1、P40蛋白均定位于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒,以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞.CD56著色部位均在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜,以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)背景清晰的黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞.綜合分析整張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%,著色較淡者判定為陰性(-);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%,可見(jiàn)棕黃色顆粒者判定為陽(yáng)性(+).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析.計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,用t檢驗(yàn)比較差別;計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)(n)和構(gòu)成比(%)表示,用χ2檢驗(yàn)等非參數(shù)方法比較差別.生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比較采用Log-rank法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).使用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析生存時(shí)間和生存狀態(tài)與因素之間的關(guān)系,其中,已經(jīng)死亡和存活作為因變量,其他變量作為自變量,首先進(jìn)行單因素分析,單因素分析有意義的變量進(jìn)入下一步的多因素分析,多因素分析采用逐步回歸法.P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料及與TTF-1、CD5、P40表達(dá)基本情況 198例小細(xì)胞肺癌患者平均年齡(62.7±11.7)歲.其中接受胸部放療者130例(65.7%),未接受者68例(34.3%);接受依托泊苷聯(lián)合卡鉑或順鉑方案(CE/EP)化療者161例(81.3%),托泊替康聯(lián)合卡鉑或順鉑方案(IC/IP)32例(16.2%),其他方案5例(2.5%).截止最后一次隨訪,共有156例死亡,其他42例為截尾數(shù)據(jù),死亡者平均存活天數(shù)為(588.4±498.6)d.TTF-1構(gòu)成比在截尾和死亡的患者中有顯著差異(χ2=6.007,P=0.014)(表1).

表 1 198例小細(xì)胞肺癌患者基本情況及TTF-1、CD56、P40表達(dá)情況Tab 1 Clinical characteristics and expression of TTF-1, CD56 and P40 in 198 SCLC patients

2.2 病理學(xué)結(jié)果情況 免疫組化染色顯示,198例小細(xì)胞肺癌 患者TTF-1、CD56、P40的陽(yáng)性率分別為73.2%(145/198)、88.4%(175/198)、7.1%(14/198).鏡下觀察絕大部分小細(xì)胞肺癌癌組織細(xì)胞為小細(xì)胞,形態(tài)單一,胞質(zhì)稀少,近乎裸核,核為圓形或者類圓形,染色質(zhì)較為豐富且分布較為均勻,呈細(xì)顆粒狀,核膜薄,核仁不明顯;突出特點(diǎn)是大部分組織擠壓較重,形成拉絲的染色質(zhì)條紋,形態(tài)欠清(圖1).

2.3 單因素和多因素素逐步Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析 分別通過(guò)單因素和多因素逐步Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析,發(fā)現(xiàn)調(diào)整其他因素的影響之后,TTF-1是否陽(yáng)性為小細(xì)胞肺癌患者獨(dú)立預(yù)后因素OR=0.665,95%CI:0.472-0.937,P=0.006;CD56、P40表達(dá)情況與預(yù)后無(wú)相關(guān)性.其他與被調(diào)整的、有顯著性的相關(guān)因素包括:與不吸煙者相比,吸煙指數(shù)≤400組OR=1.72,95%CI:1.061-2.789,P=0.015;與ECOG得分為0者相比,得分為2分的OR=3.551,95%CI:2.133-5.914,P<0.001;疾病處于廣泛期的較局限期的OR=2.487,95%CI:1.793-3.451,P=0.002;合并上腔靜脈壓迫綜合征(superior vena cava syndrome, SVCS)者OR=2.394,95%CI:1.49-3.846,P=0.008(表2).

2.4 生存曲線分析 TTF-1陰性者平均生存天數(shù)為(640.3±87.0)d,陽(yáng)性者平均生存天數(shù)為(1,063.0±117.5)d,兩者的生存率情況有顯著差異(χ2=5.516, P=0.019)( 圖2).

表 2 小細(xì)胞肺癌預(yù)后單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox proportional hazards model analysis of OS for SCLC patients

圖 1 HE染色圖片和部分免疫標(biāo)記物免疫組化染色圖片 (X200).A:HE染色;B:TTF-1陽(yáng)性;C:CD56陽(yáng)性;D:P40陽(yáng)性.Fig 1 HE staining and biomarker expression by immunohistochemistry(X200). A: HE staining; B: TTF-1 positive; C: CD56 positive; D: P40 positive.

圖 2 不同TTF-1表達(dá)的小細(xì)胞肺癌患者生存分析Fig 2 Kaplan-Meier curves for SCLC patients according to TTF-1

3 討論

本研究通過(guò)198例小細(xì)胞肺癌,分析癌組織的免疫表型標(biāo)記物表達(dá)及其他患者臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系.3個(gè)免疫組織化學(xué)標(biāo)志物中,TTF-1、CD56處于較高表達(dá)水平,陽(yáng)性比例超過(guò)70%,P40表達(dá)水平較低,陽(yáng)性率僅為7.1%,與其他文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性.因此通過(guò)免疫表型標(biāo)志物陽(yáng)性情況可對(duì)小細(xì)胞肺癌的具有輔助診斷和鑒別診斷作用,當(dāng)然診斷應(yīng)結(jié)合其他小細(xì)胞肺癌的臨床特征,最終確診仍要靠病理.小細(xì)胞肺癌的預(yù)后與免疫表型標(biāo)志物及臨床情況等多個(gè)因素相關(guān),TTF-1是否陽(yáng)性為小細(xì)胞肺癌患者獨(dú)立預(yù)后因素,表現(xiàn)為TTF-1陽(yáng)性的患者生存期可能更長(zhǎng),其他兩種標(biāo)志物CD56、P40表達(dá)情況與預(yù)后沒(méi)有相關(guān).臨床因素方面,與不吸煙者相比,吸煙、ECOG評(píng)分、分期是小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立相關(guān)因素,表現(xiàn)為吸煙者、ECOG評(píng)分較差、廣泛期患者生存期更短.

TTF-1為甲狀腺特異性增強(qiáng)子結(jié)合蛋白,作為一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子,主要在前腦、甲狀腺上皮、胚胎肺泡上皮細(xì)胞以及正常成人氣管及肺泡上皮細(xì)胞中,尤其是許多肺部腫瘤包括肺腺癌、小細(xì)胞肺癌等等[5].TTF-1與癌癥發(fā)生、分化以及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān),在肺癌的診斷和預(yù)后中較為重要,但作用機(jī)制不是很清楚.TTF-1是II型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志物,參與調(diào)節(jié)肺上皮組織發(fā)育、分化,陽(yáng)性者可能表示癌組織尚具有部分正常分化能力,侵襲力較弱[6,7].有關(guān)TTF-1與小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系研究較少,結(jié)論也不一致.Kasmann等[8]對(duì)放射治療的局限性小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn),TTF-1沒(méi)有進(jìn)入預(yù)后的多因素分析模型.Misch等[9]研究認(rèn)為TTF-1與晚期小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后沒(méi)有顯著相關(guān),但可作為一線化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo).關(guān)于TTF-1和肺癌預(yù)后的關(guān)系在非小細(xì)胞肺癌的研究中更加常見(jiàn),但是研究結(jié)論也存在不一致,有研究發(fā)現(xiàn),Martins等[10]通過(guò)51例肺腺癌觀察認(rèn)為,TTF-1可以作為肺腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo).Yaman等[11]通過(guò)80例非小細(xì)胞肺癌研究認(rèn)為,TTF-1與患者的生存相關(guān)沒(méi)有顯著性.Tan等[12]隨訪觀察認(rèn)為,TTF-1陰性表達(dá)者非小細(xì)胞肺癌更具侵襲性,陽(yáng)性表達(dá)者中位生存期明顯超過(guò)陰性表達(dá)者,可以作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后指標(biāo).

TTF-1表達(dá)在不同部位、不同組織、不同器官、不同類型腫瘤是存在差異的,如在肺腺癌中表達(dá)率較高,也有研究[13]認(rèn)為與腫瘤的不同分期有關(guān),在TNM分期越高的小細(xì)胞肺癌患者中,陽(yáng)性率越低.雖然本研究認(rèn)為TTF-1在小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)水平較高,陽(yáng)性率為83%,與其他研究相似,但其表達(dá)與年齡、性別、分期等臨床特征無(wú)關(guān).高宗煒等[14]研究發(fā)現(xiàn)TTF-1 DNA結(jié)合活性在肺癌組織較高,肺腺癌組織TTF-1 DNA結(jié)合活性光密度值顯著高于其他病理類型.有研究分析非肺來(lái)源的小細(xì)胞肺癌,認(rèn)為其他部位的小細(xì)胞癌與肺小細(xì)胞癌具有不同的標(biāo)志物表達(dá)譜.Ordonez[15]發(fā)現(xiàn)肺外小細(xì)胞癌中TTF-1表達(dá)陽(yáng)性率僅為7.4%,顯著低于小細(xì)胞肺癌的96%.Yao等[16]對(duì)前列腺小細(xì)胞癌研究發(fā)現(xiàn),TTF-1陽(yáng)性率高達(dá)83%.因此TTF-1不是某個(gè)組織來(lái)源的特異性標(biāo)志物,而與腫瘤細(xì)胞來(lái)源有關(guān),這主要是神經(jīng)內(nèi)分泌來(lái)源的腫瘤細(xì)胞.通過(guò)分析非肺來(lái)源的小細(xì)胞癌以及小細(xì)胞肺癌中其他神經(jīng)內(nèi)分泌來(lái)源標(biāo)志物也同時(shí)可以印證這一點(diǎn),比如CD56 在本研究中也有較高陽(yáng)性率.

總之,本研究認(rèn)為小細(xì)胞肺癌中的預(yù)后與TTF-1表達(dá)及吸煙、ECOG得分、癌瘤分期、合并SVCS等多個(gè)因素相關(guān).TTF-1、CD56、P40等免疫表型標(biāo)志物在部分小細(xì)胞肺癌病理組織中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá),對(duì)小細(xì)胞肺癌的診斷和鑒別具有輔助作用.但是本研究為單中心、回顧性研究,有一定的局限性,未來(lái)還需要前瞻性、大樣本、多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證.