錢坤 張毅 支修益

IPASS、OPITIMAL等試驗奠定了表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)在有EFGR突變的晚期非小細胞肺癌患者中的一線治療地位,在EGFR突變的人群中其有效率可達80%以上[1,2],但是仍然有20%左右的EGFR突變患者治療效果并不理想,表現(xiàn)為原發(fā)性耐藥或者無進展生存期(progression free survival, PFS)較短,許多研究[3,4]提示可能存在其他信號通路和基因位點影響TKI的療效.BCL-2蛋白家族是細胞凋亡進程中的重要調節(jié)蛋白,BIM基因作為 BCL-2家族成員之一,是參與細胞凋亡的重要介質.研究[5,6]發(fā)現(xiàn)東亞人群中BIM基因的2號內含子存在缺失多態(tài)性,導致患者會表達缺乏BH3結構域,即沒有促凋亡活性的BIM亞型,從而引起該類患者對EGFR-TKIs的原發(fā)耐藥或削弱TKIs的臨床療效.本研究通過對晚期肺腺癌患者的BIM多態(tài)性檢測,分析BIM多態(tài)性與EGFR-TKIs藥物療效相關性,并探索不同類型標本BIM檢測的相關性.

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究入選2013年2月-2014年11月間經(jīng)宣武醫(yī)院胸外科診斷明確的IIIb期-IV期肺腺癌患者85例,其中男性30例,女性55例;年齡范圍35歲-82歲,中位年齡58歲;臨床分期IIIb期34例,IV期51例;有吸煙史29例,無吸煙史56例(表1).所有患者均于接受TKI藥物之前通過穿刺或者手術的方式取得病理組織.入選標準:①腫瘤-淋巴結-轉移(tumor-node-metastasis, TNM)分期為IIIb期-IV期的肺腺癌,有EGFR基因19和/或21外顯子敏感突變;②患者年齡18歲-80歲;③血液學、生化和器官功能:血紅蛋白≥100 g/L;中性粒細胞絕對計數(shù)≥2.0 X109/L;血小板計數(shù)≥100X109/L;總膽紅素≤1.5倍正常值上限;谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶≤2.5倍正常值上限;肌酐≤1.5倍正常值上限;且肌酐清除率≥60 mL/min;④美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)行為狀態(tài)評分0分-2分,預期壽命大于12周.排除標準:①既往合并惡性腫瘤病史;②已知對吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺嶂械娜魏纬煞诌^敏;③既往患間質性肺病,基線時計算機斷層掃描(computed tomography, CT)掃描發(fā)現(xiàn)存在特發(fā)性肺纖維化;④任何不穩(wěn)定的內科系統(tǒng)性疾病和感染性疾病;④已知的人類免疫缺陷病毒感染;⑤混有小細胞肺癌成份的患者;⑥懷孕或哺乳期婦女;

1.2 標本來源組織切片樣本 所有樣本均為首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院收集,病理明確診斷為肺腺癌,采用甲醛固定石蠟包埋(formalin-fixed and parrffin-embedded, FFPE)組織切片樣本,5 μm厚切片不少于10片,室溫存放.樣本中的腫瘤組織至少占整個樣本的30%.全血樣本:使用EDTA抗凝劑的真空采血管,取不少于4 mL的全血,存放于2oC-8oC、24 h內送檢.

1.3 治療方法 患者根據(jù)不同情況治療給予吉非替尼250 mg 1次/日或者厄洛替尼150 mg 1次/日或者埃克替尼125 mg 3次/日口服,因疾病進展或不能耐受的毒性反應而停止.患者服藥后4周進行一次胸部CT平掃,根據(jù)實體瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)標準進行判效,若腫瘤沒有進展(progressive disease, PD)可繼續(xù)服藥,此后需每4周一次訪視,口服藥物8周后進行最終判效.服藥期間每8周進行一次胸部CT掃描復查直至疾病進展或發(fā)生不能接受的毒性反應停藥.

1.4 樣本DNA提取 FFPE樣本使用德國Qiagen公司的石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取FFPE樣本基因組DNA,將病理組織從切片中提取,全血樣本采用Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取全血樣本基因組DNA,按照使用說明進行操作,石蠟樣本和全血樣本提取的DNA樣品滿足OD260/OD280=(1.8±0.2),OD260/OD230≥1.7;濃度為20 ng/μL-50 ng/μL.DNA于-20oC貯存至使用.

1.5 EGFR基因突變檢測 采用北京雅康博生物科技有限公司生產(chǎn)的人EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法),實時熒光PCR儀為Stratagene Mx3000P,循環(huán)設置為:95oC、10 min;95oC、15 s,60oC、1 min,共40個循環(huán).

1.6 BIM基因多態(tài)性檢測 采用北京雅康博生物科技有限公司生產(chǎn)的人BIM基因多態(tài)性檢測RUO試劑盒(熒光PCR法),實時熒光PCR儀為Stratagene Mx3000P,循環(huán)設置為:95oC、10 min;95oC、15 s,60oC、1 min,共40個循環(huán).

1.7 統(tǒng)計分析 通過SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析,不同BIM結果的患者服藥的客觀有效率(objective response rate,ORR)間差異采用Fisher's精確檢驗進行分析;多因素分析采用Cox回歸;單因素分析采用Kaplan-Meier分析及Logrank檢驗.生存曲線采用GraphPad Prism 5 Project軟件制作.所有統(tǒng)計分析過程中,雙側檢驗P<0.05為存在統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 EGFR基因突變檢測和BIM基因多態(tài)性結果 自2013年2月-2014年11月,收集EGFR 19、21外顯子突變85例.其中19外顯子突變35例,21外顯子突變50例(圖1).根據(jù)85例石蠟組織樣本BIM基因多態(tài)性檢測結果顯示,BIM基因缺失14例(16.47%),純和無缺失71例(83.53%).在13例對照樣本中,石蠟樣本檢出BIM基因缺失2例(15.4%);血液樣本檢出BIM基因缺失2例(15.4%),且為相同患者樣本.

2.2 BIM基因多態(tài)性與一般臨床特征的關系 BIM基因多態(tài)性與患者年齡、性別、分期及吸煙史均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2).

2.3 BIM基因多態(tài)性與短期療效和無進展生存的關系 82例具備短期療效數(shù)據(jù)的患者中,不同BIM多態(tài)性的患者在應用藥物后的客觀有效率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3).在上述82例具備短期療效數(shù)據(jù)的患者中,有67例患者的隨訪數(shù)據(jù)可供PFS分析.隨后采用Kaplan-Meier曲線分析BIM基因多態(tài)性與該67例患者PFS之間的關系(圖2).BIM基因缺失、無缺失患者接受藥物治療的中位PFS分別為7.1個月、12.8個月,且存在統(tǒng)計學差異(P=0.013).

圖 1 EGFR突變檢測圖譜Fig 1 The amplification plots of EGFR mutation. EGFR: epidermal growth factor receptor

2.4 單因素分析PFS結果 從表4可以看出BIM基因多態(tài)性、無多態(tài)性患者接受藥物治療的中位PFS分別為7.1個月、12.8個月,且存在統(tǒng)計學差異(P=0.013).男性和女性中位PFS分別為10.7個月、12.1個月(P=0.835) ,無統(tǒng)計學差異(P>0.05);吸煙組和非吸煙組,中位PFS分別為9.7個月、12.1個月(P=0.974),無統(tǒng)計學差異(P>0.05); EGFR 19、21外顯子中位PFS分別為8.7個月、12.2個月(P=0.303) ,無統(tǒng)計學差異(P>0.05).

3 討論

本研究85例FFPE樣本BIM基因多態(tài)性檢測結果顯示,BIM基因缺失多態(tài)性14例(16.47%),Nakagawa等[3]研究報道BIM基因缺失多態(tài)性只存在于東方人群中,在EGFR基因突變的NSCLC患者中,BIM基因多態(tài)性率占12.9%.人類基因組單倍體圖計劃中的中國人BIM缺失多態(tài)性攜帶率為20.5%[7].鄧偉等[5]報道24.3%(42/169)的患者存在BIM缺失多態(tài)性.相比而言,德國等歐洲人群則未見BIM缺失多態(tài)性[5].不同文獻報道的BIM缺失多態(tài)性比例在12.3%-24.3%之間,本試驗16.47%的陽性率符合文獻報道范圍之內.

表 1 患者的般臨一床特征Tab 1 General clinical characteristics of the patients

圖 2 BIM基因多態(tài)性與無進展生存的關系Fig 2 Single factor analysis of the relationship between PFS and BIM gene polymorphism. PFS: progression-free survival.

表 2 BIM基因多態(tài)性與一般臨床特征相關性分析Tab 2 Relationship between BIM gene polymorphism and general clinical characteristics

表 3 BIM多態(tài)性與短期療效的差異Tab 3 Relationship between BIM gene polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor

表 4 單因素與PFS相關性分析結果Tab 4 Results of univariate analysis of PFS

BIM基因廣泛分布于機體正常組織細胞,包括破骨細胞、成骨細胞、肥大細胞、上皮細胞、血管內皮細胞和神經(jīng)細胞等正常組織中,在細胞凋亡中BIM是必不可少的,在惡性腫瘤細胞中亦有表達.在13例對照樣本中,石蠟樣本與血液樣本檢出2例結果相同的BIM基因缺失多態(tài)性,由于本研究使用的病理標本和全血標本均是患者服用EGFR-TKIs之前的標本,沒有受到藥物影響,初步證明血液樣本檢測BIM基因多態(tài)性的可行性,但是例數(shù)較少,且缺少患者用藥后的對比檢測,因此血液檢測BIM多態(tài)性的可行性有待進一步驗證.

從表2也可以看出BIM基因多態(tài)性在患者年齡、性別、分期及吸煙史等因素中分布均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),也說明BIM多態(tài)性是廣泛分布于人群中的一種隨機性分布,不因患者性別等先天因素或者吸煙等后天環(huán)境所改變.但是有文獻[8]報道某些藥物如AZD6244能夠增強FOXO3的表達,進一步提高BIM表達和誘導細胞凋亡.

從表3可以看出82例具備短期療效數(shù)據(jù)的患者中,BIM多態(tài)性組ORR為28.57%,而BIM無多態(tài)性組為39.71%,兩組統(tǒng)計學上無顯著差異.說明對于有EGFR突變的晚期肺腺癌,BIM多態(tài)性并不是一線使用TKIs治療有效性的預測因素.鄭蕾等[9]報道,在123例復治晚期非小細胞肺癌患者中,化療失敗后接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療,其ORR和疾病控制率(disease control rate, DCR)在BIM多態(tài)性和無多態(tài)性人群中也無統(tǒng)計學意義.

本研究有67例患者的隨訪數(shù)據(jù)可供無進展生存分析,通過圖2可以看出BIM基因具有缺失多態(tài)性、無多態(tài)性患者接受藥物治療的中位PFS分別為7.1個月、12.8個月,且存在統(tǒng)計學差異(P=0.013),說明BIM多態(tài)性與TKI一線治療晚期肺腺癌的長期療效相關.由于BIM基因的2號內含子存在缺失多態(tài)性,導致產(chǎn)生沒有促凋亡活性的BIM亞型,從而引起該類患者對EGFR-TKIs削弱的臨床療效,但是這一過程為何表現(xiàn)出只是PFS的差異而不是原發(fā)性耐藥的方面的差異仍不得而知.Costa等[10]研究結果證實,對吉非替尼等TKIs有效的肺癌患者癌細胞內BIM表達數(shù)量顯著增加,而BIM基因敲除后原來敏感的腫瘤細胞則對TKIs耐藥,說明BIM表達水平在TKIs介導的腫瘤細胞凋亡過程中具有十分重要的作用.只有當BIM表達完全消失才會導致迅速耐藥,而無論是BIM多態(tài)性還是低表達所引起的是一種緩慢性耐藥,所引起的最終結果就是這類患者PFS縮短.至于BIM多態(tài)性與低表達之間的關系尚需要進一步試驗以得出結論.

除了檢驗BIM基因的多態(tài)性與中位PFS的關系外,還將性別、吸煙狀況和EGFR突變位點與PFS進行了獨立的分析.雖然非吸煙組的PFS明顯長于吸煙組,但是仍無統(tǒng)計學差異,性別和EGFR外顯子敏感突變一樣也不是PFS的獨立預測因素,這一結果表明以前認為的"亞洲不吸煙女性腺癌"是EGFR-TKIs治療優(yōu)勢人群可能是這類人群EGFR突變率較高,而并非是性別和吸煙這些因素決定的長期療效[1].

通過本回顧性研究可以得出以下結論:①BIM基因缺失多態(tài)性作為一種僅存在于東方人種中的突變隨機分布,與性別等先天因素和吸煙等后天因素無關,不同文獻報道的BIM缺失多態(tài)性比例在12.3%-24.3%[5,7,9].②BIM基因多態(tài)性的有無對晚期肺腺癌一線EGFR-TKIs治療患者的PFS有統(tǒng)計學差異,檢測患者BIM基因多態(tài)性對晚期肺腺癌 EGFR-TKIs治療患者的評估預后有一定指導意義.但是BIM基因多態(tài)性的有無對晚期肺腺癌一線EGFRTKIs治療的短期療效無法起到預測作用.③晚期肺腺癌一線EGFR-TKIs治療患者的PFS與性別、吸煙狀況等因素無關,EGFR 19和21突變位點在這類人群進行TKIs治療中PFS也無統(tǒng)計學差異.④基于BIM多態(tài)性在體細胞和腫瘤細胞檢測結果相同,雖然例數(shù)較少可以初探采用全血檢測初治病人的BIM多態(tài)性結果,但復治患者的結果有待進一步驗證.